2026年5月8日 Frontiers in Immunology

摘要

结直肠癌（CRC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一，目前的治疗方法常常受到肿瘤异质性和免疫逃逸的限制。基于疫苗的免疫疗法，特别是利用信使RNA（mRNA）技术的免疫疗法，因其研发周期短、短期内安全性良好以及具有个体化治疗的潜力，代表了一种极具前景的创新策略。本文综述了传统癌症疫苗平台的局限性，并将其与基于mRNA的疫苗的优势进行了对比。文章阐述了mRNA疫苗靶向CRC的各种机制，例如编码肿瘤相关抗原或肿瘤特异性新抗原、递送免疫刺激细胞因子以及调节免疫抑制性肿瘤微环境。此外，本文还概述了近期结直肠癌mRNA免疫疗法领域的临床试验。早期临床研究的初步证据表明，这些方法具有良好的安全性，并显示出抗肿瘤活性，展现出巨大的临床应用潜力。此外，我们还将探讨mRNA疫苗目前面临的挑战和前景。

1 引言

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症类型，尽管内镜筛查和早期检测技术取得了显著进步，并促使一些地区的结直肠癌发病率有所下降，但结直肠癌仍然是全球癌症相关死亡的第二大主要原因。此外，在许多发展中国家，结直肠癌的发病率、患病率和死亡率仍然高得惊人，预计未来十年还将进一步上升，尤其是在经历快速经济转型的地区。

CRC 的主要治疗方法是手术切除，可能还会辅以化疗或放疗等辅助疗法。尽管免疫疗法联合化疗已被证明能显著延长部分 CRC 患者（例如，错配修复缺陷/微卫星不稳定性高肿瘤患者）的无进展生存期和总生存期，但肿瘤异质性和耐药性等挑战仍然是大多数患者有效治疗的重大障碍。因此，要解决晚期 CRC 患者的这些治疗难题，可能需要替代治疗策略或新的免疫治疗方法。

疫苗的传统作用机制是通过刺激免疫系统识别和对抗特定病原体。自18世纪以来，疫苗接种最终实现了天花的彻底根除，并显著促进了对各种传染病的控制，这一成功激励人们将类似的免疫学原理应用于肿瘤学领域，使疫苗成为癌症研究领域一个充满希望的前沿方向。虽然早期的研究重点是预防病毒相关癌症，但治疗现有恶性肿瘤这一更广泛的目标推动了治疗性癌症疫苗的研发——这些疫苗旨在激活免疫系统对抗已形成的肿瘤。2010年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个治疗性癌症疫苗Sipuleucel-T（Provenge），这促进了对基于新抗原和载体的平台的研究，以克服免疫抑制并扩大疗效。随后，人们探索了多种癌症疫苗平台，每种平台都具有独特的机制和挑战。这些平台包括：基于细胞的疫苗，利用完整的肿瘤细胞或树突状细胞来呈递多种抗原；基于微生物的疫苗，采用减毒细菌或病毒载体来递送肿瘤抗原并激发强烈的先天免疫反应；基于外泌体的疫苗，利用外泌体进行递送以促进抗原呈递和免疫激活；基于蛋白质和肽的疫苗，因其设计简单、安全性高且易于生产而备受青睐；以及基于DNA的疫苗，具有高稳定性并能诱导持续的抗原表达。虽然每个平台都具有独特的优势，但它们通常受到免疫原性、生产复杂性或可扩展性方面的限制，这凸显了开发更通用、更有效的替代方案的必要性。

在 COVID-19 大流行期间，信使 RNA (mRNA) 疫苗因其独特的优势而迅速受到关注，这些优势包括良好的短期安全性、较短的研发周期和灵活的生产能力。这种关注加速了它们在癌症研究中的应用。作为一项源自分子生物学和免疫学的前沿技术，mRNA 于 1990 年首次在动物模型中通过体外转录 (IVT) 成功得到证实，在过去的几十年里，核苷酸修饰技术和递送策略的不断进步显著提高了mRNA疫苗的有效性、安全性和可扩展性。总而言之，这些进展凸显了mRNA疫苗在肿瘤预防和治疗方面日益增长的应用前景。

mRNA疫苗能够同时激活先天性和适应性免疫，使其成为一种独特的适应性平台。这种固有的多功能性，加上其快速灵活的生产方式，使其在个性化癌症免疫治疗中极具吸引力。例如，编码肿瘤特异性抗原（TSA）的mRNA构建体具有理论优势：每位患者都将mRNA翻译成蛋白质，然后以独特且个性化的方式进行加工和呈递。抗原呈递细胞（APC）可以摄取、加工这些TSA，并将其与各种人类白细胞抗原（HLA）I类和II类分子结合。如果由此产生的表位与患者的HLA分子具有高亲和力结合，则可被T细胞识别，从而在体内引发更广泛、更有效的T细胞反应。

鉴于CRC具有高度异质性和免疫逃逸的特性，mRNA疫苗为应对当前的治疗挑战提供了一种很有前景的解决方案。其快速生产和固有的可定制性使得个性化治疗平台的开发成为可能，从而促进了能够靶向肿瘤克隆多样性的多表位疫苗的设计。这种策略可能有助于降低由抗原表达异质性引起的免疫逃逸风险。此外，mRNA疫苗可以激活先天性和适应性免疫途径，诱导产生针对靶抗原的强效CD8+ 和CD4+ T细胞反应。这种免疫激活可以促进免疫学上“冷”肿瘤转化为以T细胞浸润为特征的“热”肿瘤微环境，从而有可能克服免疫逃逸机制。临床前研究和早期临床试验已显示出令人鼓舞的结果，突显了它们激活肿瘤特异性免疫反应和改善患者预后的潜力。尽管如此，在增强免疫效应、改进递送机制和保证稳定性方面仍然存在挑战。

本文综述了不同肿瘤疫苗的优缺点，重点阐述了mRNA疫苗在结直肠癌中的潜在生物学功能。此外，本文还探讨了mRNA疫苗在临床应用方面的最新进展、面临的挑战以及未来的发展方向。

2. CRC疫苗策略：从传统疫苗到mRNA平台

目前存在多种用于治疗结直肠癌的常规疫苗，根据其进入人体的最终形式，可将其分为几大类：细胞疫苗、微生物疫苗、外泌体疫苗、蛋白质/肽类疫苗和DNA疫苗。本节概述了这些常规疫苗类型，并重点讨论了每种方法在制剂或递送方面的局限性。

2.1.1 基于细胞的疫苗

细胞疫苗利用完整细胞作为抗原来源或递送载体。目前已开发的用于结直肠癌的细胞疫苗可根据其制剂和递送策略大致分为两类。第一类是肿瘤细胞疫苗，它利用完整的肿瘤细胞（通常是自体或异体细胞）作为抗原制剂。第二种类型是树突状细胞（DC）疫苗，它利用DC作为递送系统。通过将肽或mRNA加载到树突状细胞上，并将其重新输注到患者体内，它们可以发挥其作用。在这两种类型中，利用肿瘤细胞（尤其是自体肿瘤细胞）的疫苗非常适合个性化治疗方法，因为它们可以直接与患者的特定抗原谱相匹配，在各种临床前癌症模型和评估类似疫苗对 CRC 患者疗效的临床试验中，观察到抗肿瘤反应与疫苗引起的免疫反应相关。GVAX®Vigil™ 是此类药物的典型代表。在 I 期临床试验 (NCT00656123) 中，GVAX®与环磷酰胺联合使用可延长结直肠癌肝转移根治性切除术后患者的生存期；然而，对于转移性疾病负担较重的患者，其疗效可能有限。此外，还有来自另外两个 GVAX 的结果。疫苗试验表明临床疗效有限，如NCT02981524、NCT01966289所示。Vigil™虽然在其他恶性肿瘤中显示出令人鼓舞的结果（NCT01309230），但在CRC中的试验已终止。临床试验注册中心（NCT01505166）将“出于商业考量，决定探索其他适应症”列为官方原因。这一决定可能反映了自体肿瘤细胞疫苗领域固有的、广为人知的挑战，特别是其复杂的生产工艺以及从结直肠癌患者身上获取足够、有活性的肿瘤组织所面临的后勤障碍。

DC疫苗利用树突状细胞的功能，树突状细胞被认为是效力最强的专业抗原呈递细胞（APC）。通常情况下，树突状细胞（DC）用于加载抗原，随后将其输回患者体内。在一项 I 期临床试验 (NCT00558051) 中，9 名患有侵袭性和复发性恶性肿瘤的患者接受了淋巴结内注射的 DC 疫苗，该疫苗负载有灭活的自体肿瘤细胞、钥孔血蓝蛋白和泛 DR 辅助性 T 细胞表位。该队列的总生存期 > 28 个月（± 25 个月）。其中，1 名患者在治疗后实现了超过 90 个月的长期无病生存期。在另一项 I/II 期临床试验 (NCT00228189) 中，10 名结直肠癌肝转移患者在接受肝转移灶切除术前，接受了皮内和静脉注射经癌胚抗原 (CEA) 肽脉冲处理的树突状细胞。在治疗后 7 名患者的迟发型超敏反应 (DTH) 活检中检测到大量 CEA 特异性 T 细胞，这些 T 细胞在受到负载 CEA 的靶细胞刺激后，可产生大量的干扰素-γ (IFN-γ)。有趣的是，该研究的比较分析表明，转染 CEA mRNA 的树突状细胞在诱导肿瘤特异性免疫反应方面并不优于经 CEA 肽脉冲处理的树突状细胞。这种意外现象的潜在机制仍然难以捉摸；然而，正如其他肿瘤类型的研究表明的那样，它们可能源于 MHC II 类抗原加工效率的差异，或者每种疫苗接种策略诱导的不同 T 细胞亚群。这些发现凸显了DC疫苗在CRC中的潜在应用价值；然而，这些疫苗的研发过程漫长，且需要自体细胞制备，这可能与精准治疗的经济要求不符。

值得注意的是，生物工程同种异体免疫细胞疫苗 AlloStim 也已被用于治疗结直肠癌（NCT02380443、NCT01065441、NCT00861107）。该疫苗采用同种异体活化的CD4细胞+Th1 样细胞，并且故意与受体不匹配，以通过类似移植物抗宿主病的反应诱导免疫反应的重新激活。具体而言，一项与 IIb 期试验相关的病例报告记录了一例接受 AlloStim 治疗的 pMMR/MSS mCRC 患者对免疫检查点抑制剂 (ICI) 出现罕见的客观缓解。虽然这一个案提示可能存在治疗致敏作用，但ClinicalTrials.gov网站上公布的NCT02380443试验的初步结果表明，大多数受试者都出现了不同程度的不良反应。这些观察结果凸显了开展更大规模、更严格的临床试验的必要性，以严格确定这种联合治疗策略的安全性和疗效。

2.1.2 基于微生物的疫苗

微生物CRC疫苗包括细菌疫苗、病毒疫苗和酵母疫苗。这些疫苗具有固有的免疫原性，其遗传物质可以被改造以整合癌症抗原。病毒载体疫苗的研发进展相对迅速，一项针对CRC患者的I期临床试验表明，重组禽痘病毒是安全的，但只能在癌症患者中引发有限的T细胞反应。这种现象可能部分归因于中和抗病毒抗体的诱导——这是病毒载体平台面临的一个已知挑战。酵母疫苗已在多项 I 期临床试验中被证明是安全的，一项正在进行的 I 期临床试验旨在将酵母疫苗与个性化治疗方法相结合（NCT03552718）。同时，近期临床前研究表明，抗原锚定酵母疫苗可以显著激活肠道树突状细胞，从而增强免疫反应，基于细菌的疫苗，例如鼠伤寒沙门氏菌疫苗，由于其能够实现肿瘤特异性定植，已被用于其他恶性肿瘤的治疗。然而，基于微生物的疫苗需要复杂的生产工艺，这会显著延长生产周期。此外，预先存在的针对这些微生物载体的抗体可能对其在个性化治疗策略中的应用构成重大障碍。

2.1.3 基于外泌体的疫苗

基于外泌体的疫苗是指用外泌体配制的肿瘤疫苗。外泌体是由多种细胞类型分泌的微小膜囊泡，含有多种生物活性分子，并可在细胞间传递信息。它们的免疫调节功能取决于其细胞来源，例如，树突状细胞来源的外泌体可通过携带 MHC I/II 复合物来增强抗原呈递和 T 细胞活化，从而增强免疫反应。相反，肿瘤来源的外泌体则与免疫抑制和肿瘤进展有关，这反映了它们在癌症生物学中复杂的“双刃剑”作用，一项纳入 40 例转移性结直肠癌患者的 I 期临床试验评估了肿瘤腹水外泌体 (Aex) 联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 的治疗潜力。结果表明，Aex 联合 GM-CSF 组诱导了更强的抗肿瘤细胞毒性 T 细胞反应，提示其有望成为一种安全有效的治疗性疫苗。然而，基于外泌体的疫苗的治疗指数对生产纯度和标准化程度高度敏感。主要挑战之一是，源自纯化不足的肿瘤相关外泌体的疫苗可能无意中携带免疫抑制性物质，从而抵消预期的抗肿瘤反应。此外，外泌体的大规模生产和储存在临床应用中仍然面临着巨大的挑战，尽管外泌体通常被认为是生物相容的，它们的免疫原性需要进行彻底评估，这会对其临床应用产生重大影响。

2.1.4 基于蛋白质和肽的疫苗

肽疫苗和蛋白质疫苗旨在触发针对特定肿瘤抗原的免疫反应。这些疫苗主要靶向肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA）的免疫原性表位。抗原通过MHC I类或II类分子呈递在抗原呈递细胞（APC）表面，激活T细胞并诱导持久的抗原特异性免疫记忆，一般来说，肽类癌症疫苗在患者中表现出良好的耐受性。最近的一项研究表明，PolyPEPI1018联合维持治疗对微卫星稳定型（MSS）转移性结直肠癌（CRC）患者（n=11）安全且耐受性良好。该疫苗可诱导CD8+ T细胞。90% 的患者出现 T 细胞反应，其中 80% 的患者靶向至少三种抗原，客观缓解率为 27.3%。值得注意的是，两名患者在接种疫苗后符合根治性手术的条件，接受多剂疫苗的患者无进展生存期显著延长（12.5 个月 vs. 4.6 个月；P=0.017），表明有希望的临床疗效信号，在另一项研究中，Survivin-2B肽疫苗被证实对HLA-A24阳性的晚期或复发性结直肠癌患者安全，未报告严重不良事件。然而，尽管观察到免疫反应——例如一名患者体内肽特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）频率增加——但临床获益有限：15名患者中仅有6名出现短暂的肿瘤标志物下降，另有1名患者出现轻微反应，而大多数患者病情进展，这些发现凸显了基于肽的疫苗在个性化癌症免疫治疗中的关键局限性。首先，它们严格的HLA限制性使其仅适用于特定的患者亚群——这是任何基于表位的疫苗固有的局限性，但在肽疫苗中尤为突出，因为肽的表位容量有限（通常每个肽只有1-3个表位）。其次，短肽的固有免疫原性较低，通常会导致T细胞活化较弱或短暂，这反映在观察到的临床反应较弱上。与活的或灭活的病原体不同，肽缺乏病原体相关分子模式（PAMP），无法有效刺激先天免疫，因此需要使用佐剂、载体蛋白或多聚体呈递系统（例如，病毒样颗粒或纳米颗粒）来增强免疫原性。此外，构象限制也给B细胞表位设计带来了额外的挑战：线性肽通常无法模拟天然抗原结构，导致产生的抗体可能无法识别天然构象的靶蛋白。

2.1.5 基于DNA的疫苗

DNA疫苗利用DNA作为模板编码抗原，从而促进抗原转染到细胞中。虽然DNA疫苗通常比RNA疫苗成本更低且稳定性更高，但它们尚未在临床实践中得到广泛应用，这主要是由于基因组整合的潜在风险，这可能导致插入突变，以及编码抗原的长期表达所带来的挑战，具体而言，长期接触同一种抗原可诱导免疫耐受或T细胞耗竭，导致免疫系统不再将疫苗衍生的抗原识别为外来威胁，从而降低治疗效果，因此，DNA疫苗在结直肠癌治疗中的应用安全性仍然是一个重要问题。

总之，尽管传统疫苗在癌症治疗方面取得了一些进展，但仍面临一些共同的挑战。这些挑战包括免疫原性有限、个性化产品生产工艺复杂且耗时，以及免疫相容性方面的限制（例如，HLA限制）。因此，开发一种能够应对这些相互关联挑战的新型疫苗至关重要。

2.2 mRNA疫苗平台的结构和优势

2.2.1 mRNA疫苗的类型和结构特征

mRNA疫苗和传统疫苗都是为了激活免疫系统而设计的，与传统疫苗技术相比，mRNA平台在生产速度、作用机制、安全性以及个性化能力方面具有明显的优势。研究表明，这些特性赋予了mRNA技术显著的治疗潜力和战略价值，有助于应对癌症的复杂性和异质性。因此，近年来，这项技术已逐渐成为癌症疫苗研究领域的重要方向。目前，mRNA癌症疫苗主要有三种类型：传统非复制型mRNA、自扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）（图1）。传统非复制型mRNA的基本结构由一个编码靶肽序列的开放阅读框（ORF）区域组成，两侧分别是5'端和3'端的非翻译区（UTR）。该结构还通过5'端的7-甲基鸟苷酸（m7G）帽和3'端的poly(A)尾进一步稳定。5'端帽和3'端poly(A)尾的添加可以在体外转录（IVT）过程中进行，也可以在初始IVT后通过酶促添加。相比之下，saRNA包含两个ORF；其中一个编码靶抗原序列，而另一个编码病毒复制机制，该机制有助于在细胞内进行长期RNA扩增，Beissert等人开发了一种增强型saRNA，称为反式扩增RNA（taRNA）。这种方法基于双载体系统，该系统包含两个不同的模板，分别生成编码抗原的甲病毒RNA和编码复制酶的RNA。与传统的saRNA相比，taRNA的二元设计使其生产更简便，功能化也更灵活。环状RNA是广泛存在于不同物种中的RNA转录本，它通过赋予其抵抗核酸外切酶介导的降解的能力来增强分子稳定性。

图1 mRNA类型示意图。(A)常规mRNA。(B)自扩增mRNA，包含四个编码非结构蛋白（NSP1-NSP4）的基因，这些蛋白共同构成复制酶复合物。靶基因的表达由亚基因组调控启动子启动。(C)反式扩增mRNA，由两种mRNA组成：一种保留编码复制酶的基因，另一种表达目的基因。(D)环状RNA (circRNA)，由内部核糖体进入位点 (IRES)、目的基因和连接部分组成——连接部分主要指环化系统/信号和其他辅助元件（例如翻译增强元件）。UTR，非翻译区；NSP，非结构蛋白；IRES，内部核糖体进入位点。

环状RNA可以通过基因改造来促进蛋白质合成，例如通过引入内部核糖体进入位点（IRES）或包含修饰的核苷酸，如N6甲基腺苷可以提高翻译效率，这种结构稳定性使得环状RNA在体内持续表达抗原方面具有特别大的吸引力。

胞质递送后，这些mRNA构建体被宿主核糖体翻译成抗原蛋白，然后经过翻译后加工，产生功能性、正确折叠的免疫原。这些结构特征使mRNA疫苗能够在CRC中实现高效的抗原表达和免疫激活——这一优势在CRC中尤为重要，因为肿瘤间和肿瘤内的异质性构成了主要的治疗挑战。

2.2.2 mRNA疫苗的优势

mRNA疫苗相比传统方法具有多项显著优势，并且可能对多种癌症更有效。首先，基于RNA的疫苗的研发相对快速且成本低廉。体外转录技术（IVT）通过先进的工业系统革新了mRNA的生产，显著降低了生产成本。IVT工艺消除了细胞及其相关的监管障碍，与其他疫苗生产方式相比，生产周期更加快捷。其次，mRNA不具有感染性且不整合，这大大降低了不良免疫反应的风险，同时防止了外源基因整合到宿主基因组中的可能性。此外，mRNA 表达短暂，会被正常的细胞机制降解，从而增强其安全性。而且，由于各种核苷酸修饰技术的快速发展和体内递送方法的改进，现代 mRNA 表现出更高的稳定性和可定制性，同时促进快速吸收和表达。

2.2.3 实际局限性和跨平台比较

尽管mRNA平台具有变革性的优势，但其在传统疫苗策略中的实际局限性也值得关注。这些局限性主要包括以下几个方面：

（1）递送系统：精准靶向目标细胞（例如，原位树突状细胞）仍然是确保疫苗有效性的主要挑战。（2）免疫应答持久性：在确保蛋白质持续表达的同时，必须严格控制过度反应原性，以平衡疫苗的有效性和安全性。（3）生产和物流：尽管生产速度很快，但对超低温储存的依赖以及规模化生产过程中工艺稳定性的不足仍然是全球推广的瓶颈，尤其是在资源匮乏的地区。

下表清晰地比较了不同结直肠癌疫苗平台的关键属性。表1总结了不同结直肠癌疫苗平台的优缺点。

表1 结直肠癌疫苗的比较。

这一比较表明，虽然 mRNA 技术为个性化治疗提供了无与伦比的速度和灵活性，但优化递送系统以实现精确靶向（例如，原位树突状细胞）以及确保持久的蛋白质表达而不产生过度的反应原性等挑战，仍然是其在 CRC 中广泛临床应用的关键障碍。

3. mRNA疫苗在结直肠癌中的作用机制

mRNA疫苗可以通过至少两种互补机制治疗肿瘤：（1）重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）以恢复抗肿瘤免疫力；（2）触发特异性免疫反应以抑制肿瘤生长。

肿瘤微环境（TME）指的是肿瘤细胞赖以生存的特定环境，肿瘤细胞的生存环境如图2所示。肿瘤微环境（TME）由多种成分组成，包括肿瘤细胞、免疫细胞、癌相关成纤维细胞（CAFs）、细胞外基质和细胞因子。CRC细胞通过调控有利于肿瘤发展的细胞和分子来促进肿瘤生长并增强免疫逃逸。例如，TGF-β信号通路在CMS4/MSS亚型中高度激活，而部分CMS1/微卫星不稳定性高（MSI-H）肿瘤也表现出TGF-β依赖性的基质特征。它是驱动CRC肿瘤微环境（TME）中免疫细胞和基质细胞功能异质性的重要因素。TGF-β是促进Treg细胞分化的主要刺激因子之一。这些Treg细胞主要抑制结直肠癌中的CD8+ T细胞活性，在 CMS4 CRC 的小鼠模型中，肿瘤细胞分泌 TGF-β2 以激活肿瘤相关中性粒细胞，随后抑制 T 细胞活性。此外，TGF-β 诱导 CAFs 产生肌成纤维细胞表型，导致异常的细胞外基质 (ECM) 蛋白产生，从而促进 CD8+ T 细胞从 TME 中排除。

图2 结直肠癌肿瘤微环境（TME）示意图。TME由肿瘤细胞、多种免疫细胞（包括巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞和中性粒细胞）、癌相关成纤维细胞（CAFs）、细胞外基质（ECM）和异常肿瘤血管组成。肠腔来源的微生物成分定位于肿瘤附近，提示它们可能在肿瘤进展和免疫调节中发挥作用。这些细胞和非细胞成分之间的相互作用构成了复杂的TME。

缺氧和代谢改变是两种常见的现象，它们会显著影响实体瘤（包括CRC）的免疫反应。随着肿瘤的进展，中心区域的细胞在缺氧条件下上调促血管生成细胞因子和缺氧诱导因子的表达，从而加速肿瘤生长。这种现象直接影响肿瘤微环境（TME）内的免疫细胞功能；例如，缺氧会促进γδ T细胞的凋亡，这可能与具有 HLA I 类缺陷的 MSI-H CRC 特别相关，因为已证实 γδ T 细胞可通过清除失去 MHC 表达的肿瘤细胞，发挥免疫治疗的关键效应作用，缺氧还会刺激多种细胞类型（如 CAFs）分泌 VEGF 和骨桥蛋白，从而促进肿瘤内血管生成。此外，血管结构和拓扑异常会加剧肿瘤内缺氧。在体外研究和结直肠癌小鼠模型中，缺氧的副产物，包括乳酸和厌氧糖酵解代谢物，对癌相关成纤维细胞（CAFs）、T细胞和骨髓来源细胞具有广泛的促肿瘤和免疫抑制作用，这些因素会削弱免疫系统对肿瘤细胞的识别，从而阻碍肿瘤疫苗的疗效。

鉴于肿瘤微环境（TME）在结直肠癌（CRC）进展和免疫逃逸中的关键作用，靶向并重塑这一免疫抑制微环境已成为一项至关重要的治疗策略。mRNA疫苗固有的可编程性为此提供了一个多功能平台，可通过多种策略实现对TME的精准调控，包括直接免疫调节以及编码特异性抗原和免疫刺激因子。这些方法可以共同逆转免疫抑制并激活强大的抗肿瘤免疫。

3.2 mRNA疫苗激活先天免疫

mRNA疫苗具有诱导先天性和适应性免疫的潜力，从而发挥有效的抗肿瘤作用。它们通过模式识别受体（PRR）识别PAMP来启动先天免疫反应，体外合成的mRNA及其递送载体进入体内后，会被模式识别受体（PRR）识别为外源物质。这种识别会激活先天免疫反应。抗原呈递细胞（APC）产生促炎细胞因子和共刺激分子，吸引并促进免疫细胞（如T细胞、自然杀伤（NK）细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞）浸润到肿瘤微环境中，通过募集关键免疫细胞，这一过程驱动持续的抗肿瘤免疫反应，并产生适应性 B 细胞和 T 细胞免疫。

此外，mRNA的免疫原性主要由Toll样受体7（TLR7）和TLR8介导（11TLR7 在 B 细胞、巨噬细胞和树突状细胞 (DC) 上表达，其功能是检测单链 RNA (ssRNA)。TLR7 信号传导增强促炎细胞因子的产生和抗原呈递，同时还能提高记忆 B 细胞的存活率。此外，髓系分化因子 88 (MYD88)/TLR7 通路驱动 I 型干扰素 (IFN-I) 反应，并通过细胞因子分泌促进促炎状态 。该通路的刺激作用可上调mRNA疫苗诱导的适应性免疫反应，并且还介导B细胞活化，编码B细胞表位的疫苗可引发特异性抗转移效应，相反，TLR8 主要在髓系免疫细胞中高表达，包括单核细胞、髓系树突状细胞和中性粒细胞，与 TLR7 类似，TLR8 也能识别 ssRNA 及其降解产物（例如富含 GU 序列的片段），从而感知外源 mRNA 疫苗的进入。激活后，TLR8 也依赖 MYD88 进行信号转导，启动下游 NF-κB 和 MAPK 通路，并诱导促炎细胞因子（例如 TNF-α、IL-12）。值得注意的是，TLR8 的激活不仅直接促进抗原呈递细胞的成熟，而且通过与 TLR3/4 的协同作用，塑造了一种偏向 Th1 型的免疫微环境，从而增强细胞毒性T细胞的反应。此外，TLR8信号可能在调节调节性T细胞（Treg细胞）的抑制功能中也发挥一定作用，从而间接影响疫苗诱导的免疫反应的强度和持久性。

总之，这些机制表明，mRNA疫苗可以通过调节先天免疫途径来调节获得性免疫和肿瘤微环境。

3.3 编码肿瘤相关抗原的mRNA疫苗

TAA 是存在于肿瘤细胞和正常细胞上的抗原分子，包括胚胎蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，肿瘤相关抗原（TAA）常用于肿瘤的临床诊断；然而，它们并非肿瘤细胞所特有。正常细胞也能合成微量的这些抗原，并且在肿瘤细胞增殖过程中，其表达水平会显著升高。大多数哺乳动物对TAA表现出显著的免疫耐受性，这给利用这些抗原开发癌症疫苗带来了巨大挑战，因为存在中枢免疫耐受机制。临床靶向mRNA癌症疫苗的研发趋势已转向采用多种共享TAA的组合，当编码新抗原的mRNA进入体内后，会在靶细胞中产生抗原蛋白。这些蛋白被加工成肽表位，并与MHC-I分子结合。由此形成的肽-MHC-I复合物被呈递给CD8+ T细胞。激活它们分化为 CTL，直接杀死表达抗原的肿瘤细胞。此外，分泌或释放的抗原可通过MHC II类途径被抗原呈递细胞摄取和呈递。CD4+T 细胞识别这些肽-MHC-II 复合物并分化为辅助性 T 细胞，从而支持和调节正在进行的免疫反应。

CEA是最常见的肿瘤相关抗原（TAA），几乎所有结直肠癌中均有表达。因此，它在临床免疫治疗方案中具有极大的吸引力。多项临床研究表明，负载CEA肽的树突状细胞（DC）可以诱导结直肠癌患者产生抗原特异性T细胞反应。因此，理论上，由于表达多种表位，CEA mRNA疫苗的使用可能诱导更广泛、更强大的T细胞库。在其他癌症中，CEA已显示出临床疗效。例如，多项临床试验表明，编码肿瘤相关抗原（TAA）的mRNA疫苗可以诱导黑色素瘤等肿瘤的T细胞反应（NCT04526899、NCT01278940、NCT01995708）。

然而，基于TAA的mRNA疫苗在CRC中的疗效结果不一。在一项涉及CRC的I/II期临床试验（NCT00228189）中，将经mRNA电穿孔处理的外周血单核细胞作为刺激细胞，并与T细胞共培养。在迟发型超敏反应（DTH）皮肤试验中，8例患者观察到CEA肽特异性T细胞反应；相反，5例接受mRNA接种的患者未检测到CEA肽特异性反应。这种差异可能归因于多种因素的综合作用，包括患者的基线免疫状态、抗原特性、疫苗递送效率以及所用检测方法的灵敏度。有必要开展进一步研究，以评估编码肿瘤相关抗原（TAA）的mRNA（例如CEA mRNA）在结直肠癌（CRC）中的应用。

3.4 编码肿瘤特异性抗原的mRNA疫苗

肿瘤特异性抗原（TSA）特异性表达于肿瘤细胞，在正常组织中不存在。靶向TSA是癌症免疫治疗的关键策略，其中选择合适的抗原对疫苗的疗效至关重要。与易受中枢和外周免疫耐受影响的肿瘤相关抗原（TAA）不同，TSA——特别是由体细胞突变产生的新抗原——具有高度免疫原性，能够有效克服这些耐受屏障，其在体内的作用机制与第3.3节所述相同，即抗原呈递导致CD8+T细胞和CD4+T细胞活化可引发抗肿瘤反应。通过这些机制，靶向多种肿瘤特异性抗原（TSA）的mRNA疫苗编码的抗原可通过MHC I和MHC II途径呈递，从而诱导广泛的多克隆免疫反应，并有效减少因抗原丢失引起的免疫逃逸（尽管必须承认，这些基本的生物学限制无法完全消除）。临床前证据支持这种方法。例如，Zhang等人利用小鼠结肠癌（MC38）的候选新抗原开发了一种新抗原-mRNA/DC疫苗，并评估了其免疫和抗肿瘤作用。结果表明，新抗原-mRNA/DC疫苗可诱导强烈的T细胞免疫反应，并表现出显著的抗肿瘤作用，有效抑制肿瘤生长。一项I期临床试验报告显示，接受靶向新抗原的mRNA-4650疫苗治疗的四名患者中有三名产生了疫苗诱导的CD8+ 和CD4+T细胞针对编码的新抗原的T细胞反应，尽管样本量小且肿瘤异质性较大，但四例病例中有三例观察到的高应答率初步验证了TSA mRNA疫苗平台的技术可行性。这些发现也强调了在后续更大规模的试验中利用生物标志物识别患者亚组的必要性，从而推进精准免疫疗法的发展。

3.5 编码免疫刺激因子的mRNA疫苗

除了递送抗原外，mRNA技术还具有编码免疫刺激因子的灵活性，这些因子可以增强疫苗诱导的抗肿瘤免疫。虽然mRNA编码的免疫刺激因子也被探索作为独立的免疫疗法用于直接瘤内注射，但本节重点关注它们在mRNA疫苗制剂中的作用，在这些制剂中，它们与肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA）共同递送，以增强和维持免疫反应。通过编码免疫调节蛋白（例如细胞因子、共刺激配体、受体或酶），这些疫苗成分可以直接激活免疫功能并增强机体对肿瘤的防御能力。mRNA技术在疫苗设计中的一个关键优势在于能够将多种免疫刺激序列与抗原编码序列共同递送，从而激活协同通路，增强抗原特异性免疫。最常用的细胞因子包括白细胞介素-2 (IL-2)、IL-12和OX40配体。尽管最初是作为肿瘤内免疫疗法开发的，但对IL-12 mRNA的研究为疫苗研发提供了相关的机制见解。例如，在一项IL-12 mRNA的I期临床试验（NCT05392699）中，外周血样本中CXC基序趋化因子配体9（CXCL9）、CXCL10和CXCL11的水平呈剂量依赖性增加，表明IFN-γ下游信号通路被激活。治疗后第7天，CD8+ T细胞数量增加，在患者的肿瘤微环境（TME）中观察到T细胞浸润和程序性死亡配体1（PD-L1）表达升高。这些研究结果表明，将IL-12等免疫刺激因子加入mRNA疫苗中，有助于逆转局部免疫抑制，增强疫苗编码抗原的呈递。

值得注意的是，mRNA编码的免疫刺激因子还可以通过将肿瘤相关巨噬细胞（TAM）从促肿瘤的M2状态极化为抗肿瘤的M1表型来重编程TME，M1样TAM通过激活T细胞、产生炎症细胞因子和增强吞噬作用来促进抗肿瘤免疫。在疫苗制剂中，这些免疫刺激因子作为强效分子佐剂，可增强先天免疫反应以及由肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA）触发的抗原特异性适应性免疫反应。这些免疫刺激因子的存在可进一步放大由TAA/TSA触发的免疫反应，从而促进免疫系统更有效地识别和靶向肿瘤细胞。例如，在一项临床前研究中，将肿瘤裂解物与IL-23A mRNA疫苗联合使用，显著促进了全身免疫激活，并在CT26结肠癌腹腔和肺转移的小鼠模型中显示出良好的疗效。

4. 当前临床转化状态和联合治疗策略

针对实体瘤的mRNA疫苗疗法的临床转化研究正在迅速推进，在结直肠癌（CRC）领域的探索也呈现出多元化的趋势。基于mRNA的治疗方法正日益成为对抗肿瘤免疫逃逸的一种有前景的策略。然而，临床试验设计的科学严谨性和安全性管理，以及CRC中肿瘤的异质性和免疫抑制性肿瘤微环境（TME），仍然是当前面临的重大挑战。正在进行的临床试验的多样性总结如下表2所示。

表2 正在进行的针对结直肠癌的mRNA疫苗临床试验。

4.1 患者分层：预测 CRC 疫苗反应性的生物标志物

针对肿瘤新抗原的个性化疫苗是核心方向之一（例如NCT06195384、NCT05949775等）。这一趋势体现了精准医疗的理念，但也面临着新抗原筛选、HLA限制性分析和克隆评估等技术挑战。就临床试验设计而言，此类研究通常需要使用复合终点：在探索的早期阶段，主要关注安全性相关指标（例如最大耐受剂量、剂量限制性毒性）。此外，传统的反应标准——形态学标准（例如RECIST）——通常无法准确、及时地反映免疫疗法（包括个性化疫苗）的治疗效果。因此，采用循环肿瘤 DNA (ctDNA) 和个性化癌症疫苗的免疫原性（通过 ELISpot 或 TCR 测序）等替代终点作为复合终点来精确评估有效性也变得不可避免。

其次，联合疗法已被广泛采用，其理论基础在于同时激活免疫系统并消除其抑制机制。初步临床研究已显示出其潜力，在一项针对晚期转移性实体瘤患者的研究（NCT03639714）中，发现一种结合了黑猩猩腺病毒和saRNA新抗原疫苗的个性化疫苗方案安全且耐受性良好。此外，在一些MSS CRC患者中观察到总生存期（OS）的改善。mRNA-5671/V941单药治疗或与帕博利珠单抗联合治疗，在结直肠癌患者中未观察到剂量限制性毒性（DLT）（NCT03948763），但在部分受试者中观察到免疫激活迹象。然而，大多数患者经历了不同程度的不良事件，凸显了其安全性特征的复杂性。因此，如何区分mRNA和其他药物（如免疫检查点抑制剂（ICI））的作用，以及如何避免毒性叠加，仍然是核心问题。为了明确疗效来源，可能需要采用三臂试验设计（ICI 单药治疗、疫苗单药治疗和联合治疗），或者通过追踪疫苗特异性 T 细胞的克隆扩增来确定疗效信号。联合疗法的安全管理至关重要。根据目前的临床试验结果，mRNA疫苗本身的背景风险（如发热和注射部位反应）通常是可控的。然而，当与免疫检查点抑制剂（ICI）联合使用时，免疫相关不良事件（irAEs）的理论风险会增加。因此，需要制定明确的管理策略：密切监测高危患者，制定免疫相关不良事件（irAE）干预计划，并探索预防措施。优化疫苗接种时机是提高治疗效果的关键。对于术后微小残留病灶患者，由于晚期肿瘤负荷尚未抑制免疫系统，因此是接种疫苗的理想时机。此外，Grippin 及其同事证明，SARS-CoV-2 mRNA 疫苗可以暂时重置肿瘤免疫界面，将“冷”肿瘤转化为对程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1)/PD-L1 阻断有反应的肿瘤。这可能是迈向精准肿瘤学的关键一步，治疗方案的设计将基于“机会窗口”，以mRNA疫苗和免疫检查点抑制剂的联合使用为中心。

第三，新型平台不断涌现，其中基于环状RNA的疫苗（例如circFAM53B，NCT07245901）代表了一种增强抗原表达稳定性和持久性的创新方法。这项技术突破有望实现更持久的抗原表达和更强的免疫记忆。然而，条件性免疫激活的可能性引发了人们对其安全性和可控性的担忧，早期试验需要密切监测过度炎症反应（如细胞因子风暴），并评估长期风险。

总之，目前mRNA疫苗临床试验的趋势不仅体现在技术迭代上，也体现在对设计科学性和安全性的深入考虑上。未来的研究应整合生物标志物分层、精确的终点选择、合理的时间安排和积极的毒性管理，以促进该疗法在结直肠癌中的临床转化。

4.2 结直肠癌疫苗反应的生物标志物及患者分层

mRNA疫苗在诱导抗肿瘤免疫方面的临床疗效在不同类型的结直肠癌患者中存在差异。这种异质性凸显了预测性生物标志物在患者选择和指导制定合理的联合治疗方案方面的重要性。

4.2.1 MSI-H/dMMR 与 MSS/pMMR

MSI-H/错配修复缺陷型（dMMR）和 MSS/错配修复功能正常型（pMMR）是结直肠癌中最基本的分子亚型，对临床免疫治疗有深远的影响。

MSI-H/dMMR CRC 约占所有病例的 15%（早期和右侧肿瘤的患病率较高），其特征是 DNA 错配修复系统缺陷。由于MSI-H/dMMR型结直肠癌具有高抗原负荷和免疫浸润特征，因此被认为是mRNA疫苗策略的一个有希望的候选人群。

此外，MSS CRC 的肿瘤微环境通常表现出免疫抑制特征。然而，这些障碍并不排除基于疫苗的治疗策略的治疗潜力。新兴的临床数据表明，基于 mRNA 的平台，特别是当靶向个体化新抗原时，对这类患者群体具有治疗前景.通过重塑肿瘤微环境，这种综合策略可以与疫苗协同作用，引发持久而强大的免疫反应。

因此，MSI状态在患者分层中起着至关重要的筛查作用。然而，必须承认MSI组内部存在异质性。例如，MSH2/MSH6缺陷型肿瘤的平均肿瘤突变负荷（TMB）通常高于MLH1/PMS2缺陷型肿瘤；而携带POLE/POLD1突变的MSS肿瘤则具有超高突变表型（通常每兆碱基超过100个突变）。MSI 组内的这种异质性进一步凸显了其他生物标志物的重要性，例如绝对 TMB 值、新抗原的克隆性或 MMR 缺陷的特定遗传驱动因素，这些标志物在优化患者选择和个性化疫苗方法的有效性方面具有重要意义。

4.2.2 肿瘤突变负荷、新抗原质量和HLA限制

TMB 提供了一种连续且定量的基因组不稳定性测量方法，可以进一步细化上述分层。TMB 通常定义为每兆碱基的体细胞非同义突变总数，可作为潜在新抗原库的指标。然而，TMB与疫苗反应性之间的关系并非线性关系；高突变负荷并不能保证存在免疫原性表位，也不能涵盖抗原呈递和免疫逃逸之间复杂的相互作用。因此，需要考虑从抗原产生到呈递的整个过程。有证据表明，高突变负荷并不能始终如一地预测免疫原性表位的存在，也不能解释抗原呈递和免疫逃逸机制之间复杂的相互作用。因此，对整个过程（从抗原生成到呈递）进行多维度评估，对于更好地理解和预测疫苗效力至关重要。

新抗原的克隆性和免疫原性对于有效激活免疫反应也至关重要。CRC表现出广泛的分支进化特征，克隆性新抗原稀少，主要为亚克隆性新抗原。克隆性新抗原可驱动肿瘤完全清除；而亚克隆性新抗原则容易导致免疫逃逸。此外，预测新抗原的免疫原性和突变基因的实际表达对于确保新抗原能够真正被呈递也至关重要。mRNA疫苗表达的新抗原由HLA呈递。然而，约21%至28%的结直肠癌患者存在HLA杂合性缺失（HLA-LOH），这会导致抗原呈递途径的中断，这也与大量的亚克隆新抗原有关。因此，有必要验证MHC表达的质量，理想情况下，应根据相应的MHC表达来选择新的表位。

4.2.3 肿瘤微环境的免疫抑制特征

CRC TME通常具有免疫抑制作用，其复杂的组成决定了疫苗诱导的T细胞反应的有效性。从转录组学的角度来看，CMS分类进一步细化了TME的免疫表型。例如，在CMS1肿瘤中，T细胞浸润密集，但PD-1和TIM-3等检查点的高表达反映了T细胞的耗竭状态，这表明在应用mRNA疫苗时有必要联合使用免疫检查点抑制剂（ICI）。在CMS4亚型中，活化的CAFs会沉积大量细胞外基质，CAF富集的患者可能受益于TGF-β抑制剂或基质重塑药物，从机制上讲，这可以与mRNA疫苗协同作用。此外，CMS2/3肿瘤通常被归类为免疫沙漠亚型，T细胞浸润极少。对于这类“冷”肿瘤，通过化疗诱导免疫原性细胞死亡可能是将其转化为“热”肿瘤的关键步骤，从而提高后续疫苗接种的疗效。值得注意的是，大多数 CRC 肿瘤都表现出肿瘤内异质性，这凸显了多点动态检测和更精确的 TME 生物标志物（例如 T 细胞耗竭评分和 CAF 富集水平）在 mRNA 疫苗和联合疗法的临床应用中的重要性。

5. 未来方向

mRNA疫苗在结直肠癌免疫治疗领域具有巨大潜力。然而，仍需开展进一步的研究和临床试验，以优化其疗效、安全性和长期获益。未来潜在的研究方向和进展包括：

5.1 优化mRNA疫苗设计

mRNA可通过激活先天免疫反应诱导细胞因子产生。然而，细胞因子过度或持续释放可能导致严重的副作用，包括自身免疫反应，并可能干扰针对疫苗抗原的特异性免疫反应。过度的先天感知可能损害翻译并缩短表达持续时间，而过度抑制内在免疫刺激信号可能削弱树突状细胞活化和T细胞启动。因此，下一代mRNA设计应着重于微调而非消除先天免疫刺激。RNA水平的优化应不仅限于核苷替换，还应包括对5′端帽、非翻译区、poly(A)尾、密码子使用和RNA二级结构的协同改造，其目标不仅是控制表达强度，还要控制表达动力学和免疫学结果。此外，体外转录（IVT）制备过程通常会产生双链RNA（dsRNA）副产物。这些双链RNA杂质可以激活细胞内免疫感知通路，例如上调蛋白激酶R和寡腺苷酸合成酶，从而触发I型干扰素介导的免疫反应，导致mRNA快速降解并降低疫苗效力。虽然在工业环境中，通过高效液相色谱 (HPLC) 或 RNase III 酶消化去除 dsRNA 在技术上是可行的，但这些下游纯化方法在可扩展性和高运营成本方面面临着重大挑战。因此，未来的研究应优先考虑上游工艺优化，例如改进体外转录（IVT）参数和设计更精确的RNA聚合酶，以从源头上减少双链RNA（dsRNA）的形成，从而提高mRNA疫苗的纯度和效力。最后，递送系统的优化不仅应保护mRNA免受降解，还应改善组织分布、抗原呈递细胞靶向性、重复给药耐受性和安全性。因此，未来的进展可能取决于将 RNA 工程、免疫调节和精准递送相结合的综合策略，以产生更有效、更具临床转化价值的 mRNA 癌症疫苗。

5.2 mRNA疫苗储存方法的创新

新技术的开发对于稳定疫苗至关重要，同时还能解决传统冻干储存的一些局限性。喷雾干燥和冷冻干燥技术为mRNA制剂的室温稳定储存提供了一条切实可行的技术途径。例如，mRNA-1273 可在 -20 °C 的冰箱中保存 6 个月，也可在 2 °C 至 8 °C 的冷藏环境中保存 1 个月。未来的研究重点将放在优化配方上，以进一步延长mRNA的保存时间。特别是，开发非冷冻液体配方将对资源匮乏地区mRNA疫苗制剂的广泛应用产生深远影响。此外，建立干燥状态下的长期稳定性评价体系，以及开发适用于不同mRNA序列（例如自扩增mRNA）的通用冻干工艺，也将是后续研究的重要方向。

5.3 注射途径的选择

注射途径对于靶蛋白的翻译效率和基于mRNA的癌症疫苗的分布至关重要。静脉注射仍然是目前临床试验中基于mRNA的癌症疫苗最常用的途径，并且能够有效靶向多个淋巴器官。然而，这种方法也可能导致脱靶效应，例如全身炎症反应。同时，皮下注射广泛应用于早期癌症RNA疫苗，例如CV9103。这种方法利用皮肤中高密度的树突状细胞和丰富的淋巴管来诱导有效的免疫反应，但可能会引起局部副作用。临床前和临床研究已探索了多种注射途径，包括静脉注射、皮下注射、皮内注射、瘤内注射和淋巴结内注射。然而，仍需开展全面的实验，以充分发挥基于mRNA的癌症疫苗的巨大潜力。

5.4 联合治疗

mRNA疫苗与免疫疗法的联合设计已显示出初步成功。通过分子通路和免疫动力学的结合，可以实现协同作用，例如mRNA疫苗通过I型干扰素诱导“干扰素窗口”，与免疫检查点抑制剂联合使用产生协同作用，从而达到最大疗效，未来的研究应侧重于临床验证以及在多模式时间方案下的联合给药。

5.5 生物标志物开发

随着CRC mRNA疫苗临床研究的进展，未来的研究应着重关注疫苗驱动的免疫反应的动态生物标志物。由于该疗法通过激活免疫系统发挥抗肿瘤作用，其临床疗效可能无法通过常规影像学评估反映出来（例如，可能出现假性进展（肿瘤暂时增大）或在疾病负荷相对较轻但影像学未见明显缓解的病例中观察到良好的治疗效果）。例如，ctDNA 是一种非侵入性和灵敏的动态监测标志物；治疗期间其水平的下降与总生存期的延长具有潜在的相关性，尤其有助于对分子缓解且病情稳定的患者进行精确分层，正如传统影像学所显示的那样。生物标志物有助于患者分层、治疗监测和治疗反应评估，从而实现个性化治疗策略。

6 结论

随着众多临床试验的开展，mRNA疫苗已展现出令人鼓舞的早期结果，证明了其在结直肠癌治疗中的安全性、可行性和潜在疗效。作为一种模块化和可定制的平台，这些疫苗可通过多种途径诱导肿瘤特异性免疫反应，同时还能调节肿瘤微环境。这使其成为一种极具前景的治疗方法。总之，该领域的持续研究和进展有望革新结直肠癌免疫治疗，为患者提供更有效、更个性化的治疗选择。