2025年11月25日发表于Cells

亮点

主要发现是什么？

摘要

CAR-T 细胞疗法是一种很有前景的癌症治疗方法，但它也存在一些不足。这些不足促使科学家们探索使用更安全的 CAR-NK 细胞以及新的基因修饰方法，以提高 CAR-T 细胞的疗效。本文分析了现有的 CAR-NK 细胞修饰方法，并讨论了 CAR-NK 疗法临床试验的结果。传统上，NK 细胞修饰方法可分为三大类：增强抗肿瘤细胞毒性的策略、提高 CAR-NK 细胞存活率和延长其在体内持久性的策略以及提高 CAR-NK 细胞安全性的策略。本文介绍了 CAR-NK 细胞对不同类型肿瘤的影响，并且 CAR-NK 细胞临床试验的数量逐年增加，迄今为止已取得积极成果。截至 2025 年 9 月，所有试验均处于早期 1-2 期研究阶段，预计首个 CAR-NK 产品将在不久的将来获批上市。

1. 引言

过继性细胞疗法是一种有前景且快速发展的癌症治疗方法，于 20 世纪末发展起来，基于使用免疫系统细胞来刺激抗肿瘤免疫反应。细胞免疫疗法的首个也是最重要的临床成功与使用嵌合抗原受体（CAR）T 细胞治疗血液系统恶性肿瘤相关，这已导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了 7 种 CAR-T 细胞产品。

CAR-T 细胞疗法是一种新方法，相较于传统癌症治疗方法具有明显优势。CAR-T 细胞疗法的使用已显示出对某些类型血液系统癌症的高效性，因为它们对癌细胞上存在的抗原高度特异，并且可以在体内长期存留。这些疗法能有效破坏癌细胞，防止转移，且无需手术干预。此外，CAR-T 细胞不仅能直接靶向肿瘤，还能通过刺激患者的免疫系统间接发挥作用。然而，尽管 CAR-T 细胞疗法有许多优点，但仍存在一些显著缺点限制了其广泛应用。这些缺点包括发生细胞因子释放综合征、血细胞减少和神经毒性的高概率，这些可能导致诸如感染性疾病等严重副作用。此外，CAR-T 疗法有几个严重的局限性，包括由于其免疫抑制微环境而对实体瘤疗效低，以及由于肿瘤异质性导致的高复发风险。CAR-NK 细胞疗法的开发部分解决了与 CAR-T 细胞疗法相关的副作用，因为它对实体瘤的疗效有所改善，并且没有细胞因子释放综合征或神经毒性。CAR-NK 细胞疗法的其他固有优势包括：与 CAR-T 细胞疗法相比安全性更高，以及其固有的以非特异性方式破坏肿瘤细胞的能力，并且对实体瘤有更好的细胞毒性作用。最近在开发具有嵌合抗原受体的基因工程 NK 细胞方面取得的进展提高了其安全性和抗肿瘤疗效。FT522 CAR-NK 细胞产品就是一个例子。该产品设计含有 CD38 基因敲除，以及编码抗 CD19 CAR 的基因表达、不可切割的高亲和力 CD16 受体、与 IL-15R 连接的 IL-15（即 IL15/IL15RF，或 IL15/IL15R 融合）和一个合成的同种异体免疫防御受体（ADR）。迄今为止，尚无 CAR-NK 细胞产品获得 FDA 或 EMA（欧洲药品管理局）注册。然而，此类产品的临床试验正在各个阶段积极进行，探索开发 CAR-NK 细胞的不同方法。

2. NK 细胞生物学与癌症进展

自然杀伤细胞（NK 细胞）是天然免疫的效应淋巴细胞。它们的功能特点是对外来病原性靶标和病理改变的宿主细胞都具有直接和间接的细胞毒性作用。所有成熟 NK 细胞的 90% 存在于外周血循环中。与其他类型的淋巴细胞相比，根据不同的资料，血液中 NK 细胞的数量范围在 5% 到 15% 之间。

自然杀伤细胞的前体是骨髓中的造血干细胞。这些细胞在各种因子（如转录因子和细胞因子）的影响下，分化为 NK 细胞。根据不同表面标志物的表达，主要有三种类型的 NK 细胞：CD56brightCD16dimCD57neg；CD56dimCD16brightCD57neg；CD56dimCD16brightCD57pos。CD56brightCD16dimCD57neg 群体先于其他两种，具有较低的细胞毒性活性。然而，它们可以通过分泌 IFNγ（干扰素 γ）、TNF-α（肿瘤坏死因子 α）、GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）、颗粒酶 K 和其他生物分子来促进靶细胞死亡并减少其增殖。通过分泌各种细胞因子和趋化因子，CD56bright 群体的 NK 细胞调节其他免疫细胞的功能活性。CAR-NK 细胞可以从任何细胞群体中获得。当从外周血中分离原代 NK 细胞时，通常不会将它们分成不同的亚型，而是使用获得的全部 NK 细胞。然而，较年轻的 CD56bright、CD16dim 和 CD57neg 细胞群体被认为是最有前景的。这是由于 CAR-NK 细胞的扩增过程漫长，可能需要两到三周，且 NK 细胞寿命短。我们在文章正文中写到了这些信息。CD56dimCD16brightCD57neg 群体对靶细胞（感染或转化的）的细胞毒性最强，相较于其他两个群体。这是通过分泌颗粒酶 A 和 B 以及穿孔素实现的。该群体的特点是高表达 ADCC（抗体依赖性细胞毒性）CD16 受体，低表达 NK 细胞表面蛋白 CD56，并且不表达 CD57 受体。这些细胞大部分在外周血、脾脏和骨髓中循环。CD56dimCD16dimCD57pos 群体由 CD56 受体表达降低、ADCC CD16 受体表达降低以及 CD57"成熟受体"表达增加的 NK 细胞组成。这些细胞可以被描述为记忆细胞，因为它们能有效应对先前遇到过的病原体。NK 细胞之间的表型差异不仅取决于其发育阶段，还取决于其在体内的定位以及肿瘤细胞的免疫抑制作用。这些作用可以对 NK 细胞进行重编程，使其对病原体的敏感性降低，细胞毒性减弱。

NK 细胞的抗肿瘤反应不依赖于抗原特异性启动。相反，它由激活性和抑制性受体反应的组合决定。因此，NK 细胞能够识别广泛的病原细胞，无论其来源如何。激活后，NK 细胞与病原靶细胞形成紧密连接，称为免疫突触。在此过程中，NK 细胞将细胞毒性颗粒分泌到突触中，这有助于破坏靶细胞并保护附近的正常细胞。同时，NK 细胞还分泌各种细胞因子和趋化因子，吸引其他免疫细胞到该区域并激活它们。

在进化过程中，肿瘤细胞获得了进行不受控制的突变、分裂和生长的能力，这有助于它们逃避免疫监视。这是通过破坏肿瘤细胞表面新抗原的呈递、破坏免疫细胞中的信号通路、抑制抗原呈递细胞的功能、合成免疫抑制分子以及创造不利于免疫细胞的肿瘤微环境（TME）来实现的。此外，肿瘤还吸引免疫抑制细胞，如调节性 T 淋巴细胞（Tregs）、M2 巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）等。转化细胞破坏新抗原呈递是通过 MHC1 的基因修饰或表达受损以及特异性肿瘤抗原的表达受损实现的。肿瘤细胞损伤免疫细胞信号通路的策略涉及合成免疫抑制性细胞因子，这些细胞因子可以降低 CD28、4-1BB/4-1BBL、CD3c 和其他共刺激因子的表达。肿瘤细胞还能够减少免疫细胞中抗凋亡蛋白的合成，并通过 caspase 依赖性机制引起例如 T 淋巴细胞的凋亡。同时，它们增加自身抗凋亡蛋白的表达，如 FLIP（FLICE 样抑制蛋白）、Bcl-XL（B 细胞淋巴瘤-超大）和其他蛋白。它们还表达失活的死亡受体，并减少免疫细胞表面某些趋化因子受体配体的表达。

3. CAR 细胞疗法中的遗传修饰

自首次抗肿瘤细胞疗法发展以来，就一直需要提高其杀伤肿瘤细胞、将其从体内清除以及延长 CAR 细胞寿命的有效性，使细胞疗法对癌症患者更安全。

3.1. 嵌合抗原受体的修饰策略

CAR，即嵌合抗原受体，是一种基因工程蛋白分子，能识别并结合特定抗原。它增强了携带它的免疫细胞的效应功能和存活能力。CAR 分子由四个主要结构域组成：抗原结合域、铰链区、跨膜域和信号域。

构建抗原结合域的策略涉及两种方法：一种基于针对与特定类型肿瘤相关的特定配体的抗体序列，另一种基于常规 NK 细胞受体的序列。在前一种情况下，抗原识别 CAR 域由来自单克隆抗体的轻链和重链的序列组成，也称为单链可变片段（scFv），它可以特异性结合抗体结合的特定蛋白或通用结合蛋白如亲和素。在第二种情况下，CAR 的抗原识别域由一个受体序列代表，该序列通常存在于 NK 细胞膜上，并且特异性识别通常在体内健康细胞上不存在或表达水平很低的某些配体。此类受体的一个例子是 NKG2D，它结合 MICA、MICB 和 ULBP 蛋白。NKG2DLs 是应激诱导的蛋白，存在于癌细胞表面，并且在睾丸、卵巢、胶质母细胞瘤、肺、胃、结直肠、头颈、肝、胰腺、肾、膀胱、前列腺肿瘤和黑色素瘤中发现。正常细胞缺乏这些蛋白有助于避免自身免疫反应。肿瘤进展可能导致 NKGDLs 水平降低，使得 NK 细胞更难识别和清除肿瘤细胞。然而，NK 细胞上还有许多其他激活受体仍能识别和破坏肿瘤。scFv 是抗原识别 CAR 域最受欢迎的选择。抗体序列在 scFv 中使用连接子连接。通过选择适当的长度，连接子可以稳定 scFv 的结构。最常用的连接子序列是 Whitlow 218（GSTSGSGKPGSGEGSTKG）。抗原识别域的最佳选择是对抗原特异的抗体序列，该抗原主要在肿瘤细胞上表达，在正常细胞中很少发现。这降低了 CAR 疗法对正常体细胞的毒性。在抗原在正常细胞中表达并在肿瘤细胞中增加的情况下，已开发出一种降低 scFv 亲和力的策略，使得携带 CAR 的细胞不会与正常细胞结合，而主要与肿瘤细胞反应。作为使用 scFv 作为抗原识别域基础的例子，可以考虑靶向多发性骨髓瘤的 CAR-NK 细胞。在临床研究中，BCMA（B 细胞成熟抗原）是多发性骨髓瘤最受欢迎的靶抗原，抗 BCMA-CAR-NK 细胞抗原识别域的基础是针对 BCMA 的单克隆抗体的序列。然而，这个靶抗原有其缺点。例如，BCMA 表达对人类 B 系细胞具有特异性，因此使用抗 BCMA-CAR-NK 细胞治疗多发性骨髓瘤可能潜在地消除患者的 B 细胞免疫力。研究也正在进行中，以调查抗 BCMA/GPRC5D-CAR-NK 和抗 CD70 CAR-NK 细胞疗法对多发性骨髓瘤的治疗潜力（NCT06594211，NCT06696846）。此外，对多发性骨髓瘤表面抗原的筛选已确定了其他有前景的靶点，包括 CD28（Tp44）、CD48（BLAST）、CD74（CLIP）、CD138（SDC1）、CD229（SLAMF3）、CD319（SLAMF7）、CCR10（GPR2）、TAC1（NPK）、TXNDC11、SLC1A5（AAAT）。

CAR 铰链区充当抗原识别域和跨膜域之间的连接，通过选择适当的长度，有助于稳定受体的整体构象。这反过来促进了 CAR-NK 细胞与肿瘤细胞之间稳定免疫突触的形成。铰链区通常基于 CD8a 和 CD28 的胞外域，以及 IgG 序列。基于 CD28 和 CD8a 的序列具有形成二聚体的能力，导致受体激活增强，而源自 IgG 的序列则为受体结构提供灵活性。

跨膜域将受体的胞外部分与细胞内信号域连接起来，并且能够影响 CAR 的稳定性和激活。该域通常由来自 CD3c、CD8、CD28、NKG2D、DNAM-1 和 2B4 分子的序列代表。源自 CD28 的 TM 序列可以导致更好的受体激活，但也增加了表达 CAR 的细胞中本底信号和过度激活的风险。源自 NK 细胞受体的 TM 序列可以增强表达 CAR 的细胞的细胞毒性活性。

细胞内 CAR 域在免疫细胞的激活中起着至关重要的作用。根据其设计复杂性，嵌合抗原受体可分为五代。第一代 CAR 在其细胞内域中仅包含 CD3c 信号序列。研究表明，表达这些 CAR 的 T 细胞表现出较低的抗肿瘤活性。在 CAR 的细胞内序列中添加一个共刺激域导致了第二代受体的发展，其细胞内域现在由 CD3c 和一个共刺激序列组成。第三代 CAR 的特点是在激活性的 CD3c 序列上添加了两个共刺激域。常用的共刺激域包括 CD28、ICOS、4-1BB、OX40、2B4、DAP10 和 DAP12。CD3c 结构域与 CD28 或 4-1BB 结合，最常用于创建第二代 CAR-T 淋巴细胞。另一方面，CD3c、CD28 和 4-1BB 结构域用于创建第三代 CAR-T。截至 2025 年 FDA 批准的所有 CAR-细胞疗法均包含具有 CD3c 信号域和两个共刺激域之一的第二代 CAR：CD28 或 4-1BB（见表1）。对于 CAR-NK 细胞，共刺激域如 2B4、DAP10 和 DAP12 已被证明是最佳选择。

表1. FDA 批准的 CAR-T 细胞产品。

研究发现，CD28 共刺激域引起更快、更强的细胞毒性效应。相比之下，4-1BB 诱导较弱但持续性的细胞毒性活性，并促进 CAR-NK 和 CAR-T 记忆细胞的生成。除了激活域和共刺激域，第四代 CAR 还包括调节免疫系统中其他细胞活性的序列。这些序列编码各种细胞因子、趋化因子及其受体。第五代 CAR 包括一个额外的共刺激域，以及某些转录因子的结合基序。这进一步调节了 CAR 细胞和免疫系统细胞的抗肿瘤反应。

目前，正在进行研究以提高 CAR 细胞疗法的有效性。肿瘤细胞中靶抗原表达的抑制导致它们逃脱 CAR-NK 细胞。为了解决这个问题，研究人员正在开发具有双重特异性的 CAR-NK 细胞。这种方法可以增加 CAR-NK 细胞与肿瘤靶标相互作用的概率。一个例子是抗 PD-L1/抗 MICA/MICB-CAR-NK92 细胞，它们是基于 PD-L1 抗体和 NKG2D（一种激活的 NK 细胞受体）的序列构建的。此外，通过用 FCGR3A 基因的 158V/V 多态性修饰供体外周血中的 NK 细胞，生成了抗 BCMA/抗 GPRC5D-CAR-NK 细胞。另一个例子是源自 iPSC 的抗 CD19/抗 BCMA-CAR-NK 细胞，它们也表达编码 IL-2RF 的基因以改善增殖活性，以及 tEGFR 以确保 CAR-NK 细胞的安全性。针对两种不同抗原的 CAR 细胞正在临床试验中进行研究，包括 NCT04723914、NCT03931720 和 NCT03941457。这些双特异性 CAR 细胞显示出更好的抗肿瘤活性，并且对靶细胞更具特异性。这不仅有助于解决 CAR 细胞中的胞葬作用和自身反应性问题，而且还增强了这些细胞的功能活性。现代 CAR 设计策略旨在选择能够同时提高 CAR 细胞安全性和抗肿瘤活性的遗传修饰（NCT05182073）。

3.2. 使用具有增强功能活性的高亲和力、不可切割 CD16 受体增强 NK 细胞毒性

NK 细胞的溶细胞活性与其激活性和抑制性受体反应的总和直接相关。然而，仅来自一种激活受体的信号不足以激活 NK 细胞，因为需要来自其他类型受体的额外共刺激。这防止了对正常体细胞的自身反应性。但是有一个例外：介导 ADCC 的激活受体 CD16a（FcyRIIa），它可以通过与调理化靶细胞上抗体的 Fc 片段结合，直接且独立地激活 NK 细胞。CD16a 独立于其他激活受体激活 NK 细胞的能力使其被认为是细胞免疫疗法中最有前景的候选者。CD16 是 Fcy 受体（FcyR）家族的成员，属于 FcyRIII 组。它存在两种亚型：在 NK 细胞中表达的 CD16a（FcyRIIa）和在嗜中性粒细胞上发现的 CD16b（FcyRIIB）。CD16a 结合同源或异源二聚体适配蛋白复合物 CD3ζ 和 FcRy，两者都包含 ITAM（基于免疫受体酪氨酸的激活基序）基序。CD16a 与抗体的 Fc 片段结合后，Src 家族蛋白激酶磷酸化 CD3ζ 和 FcR 蛋白 ITAM 基序中的酪氨酸残基。这为磷酸化的 ITAM 片段与 SYK（脾酪氨酸激酶）和 ZAP70（Zeta 链相关蛋白激酶 70）蛋白创建了结合位点。这导致 SLP76（含 SH2 域的 76kDa 白细胞蛋白）的双重磷酸化，确保同时与两个 VAV1 蛋白磷酸化并相互作用。这在后续分子级联中产生更强的信号，导致 NK 细胞将溶解颗粒释放到与抗体调理化的靶细胞形成的免疫突触中。与其他激活受体相比，CD16a 激活是唯一导致 SLP76 双重磷酸化的。

然而，在细胞免疫疗法的背景下，有两个因素限制了未修饰 CD16a 的潜在溶细胞活性：其与抗体 Fc 片段结合的强度及其切割。

CD16a 与抗体 Fc 片段结合的亲和力取决于 CD16a 受体的 FCGR3A 基因多态性而不同。在 cDNA 的第 559 个核苷酸位置，存在 G 或 T 核苷酸，这导致受体序列的第 158 个氨基酸位置出现苯丙氨酸或缬氨酸。第 158 位氨基酸为缬氨酸（V158）的 CD16a 蛋白具有最高的抗体结合亲和力和稳定性，而第 158 位为苯丙氨酸（F158）的受体亲和力最低（考虑信号序列，位置将为 176）。人类中占主导地位的等位基因是携带苯丙氨酸的那个。有证据表明，纯合的低亲和力变异 CD16a-176F/F 患者对治疗性抗体的治疗预后比杂合 CD16a-176V/F 或纯合 CD16a-V/V 基因型患者更差。

与调理化靶细胞上的抗体接触后，CD16a 可以触发细胞毒性颗粒的分泌（图1）。这个过程受位于 NK 细胞表面的金属蛋白酶 ADAM17（解整合素-金属蛋白酶 17）的调节。ADAM17"切割"掉 CD16a 的胞外部分。在研究中，Jing, Y. 及其同事在 P1/P1' 位置的丙氨酸195/缬氨酸196、缬氨酸196/丝氨酸197 和苏氨酸198/异亮氨酸199 附近确定了三个独立的切割位点，揭示了 CD16 中有一个膜近端切割区域。CD16a 的这种失活机制可能用于防止 NK 细胞对体内正常细胞的自身反应性，但在消除肿瘤细胞的背景下，它起到负面作用，并导致患者免疫疗法效果下降。

图1. 具有细胞内结构域的高亲和力、不可切割 CD16 受体的结构。

已经开发了不可切割和高亲和力的 CD16a，用于生成治疗性基因修饰 NK 细胞。这通过同时在第 158 位氨基酸用缬氨酸替代苯丙氨酸，以及在第 197 位用脯氨酸替代丝氨酸得以实现。受体的不可切割变体源于脯氨酸相比丝氨酸具有更刚性的环状结构。在临床前研究中，已经证明了这些修饰对肿瘤细胞消除的积极影响，无论是在体外还是体内，相较于单独使用抗体和未修饰 NK 细胞的效果。迄今为止，已开始临床试验评估高亲和力、不可切割 CD16a 对癌症患者的治疗潜力（NCT06342986，NCT05182073）。

也可以通过向 CD16a 结构中引入额外的细胞内激活域来实现细胞毒性活性的增加。在 NK 细胞或 T 淋巴细胞中发现的受体序列可用于这些结构域。CD16a 的细胞内激活域放大细胞毒性信号。CAR 设计中使用的跨膜适配蛋白片段可以作为这些序列，包括 DAP10（DNAX 激活蛋白，10kDa10kDa）或 DAP12（DNAX 激活蛋白，12kDa12kDa）、CD3C 或 FCεRIy 的信号域，以及共受体和共刺激物的序列，如 2B4、4-1BB、CD28、OX40 和 DNAM。

DAP10 和 DAP12 是与受体结合并有助于将信号传递给信号级联下游分子的适配蛋白。DAP10 与 NKG2D 激活受体相关，并包含一个 YINM（基于酪氨酸的信号传导）基序，而不是 ITAM。YINM 的磷酸化激活 PI3K 激酶或 GRB2 适配蛋白，导致细胞毒性机制的激活。DAP12 与 NKp44、KIR2DS、KIR3DS 和 NKG2C 激活受体相关。它包含一个 ITAM 序列，当受体与其配体结合时，被激酶磷酸化。这种磷酸化引起酪氨酸激酶 SYK 和 ZAP70 的参与。这些酪氨酸激酶导致下游细胞毒性信号和细胞因子分泌的激活。

CD3c 是 T 细胞 TCR 的一部分蛋白。在 NK 细胞中，CD3c 作为信号适配蛋白，通常以同源二聚体形式或与 FCεRIy 形成异源二聚体与 CD16 相关。CD3c 和 FCεRIy 也可以作为 NKp 家族受体的适配蛋白。CD3c 和 FCεRIy 都含有 ITAM 序列，这些序列通过磷酸化传递激活细胞细胞毒性的信号。这种激活是由 CD16 介导的。

3.3. 膜结合 IL-15/IL-15Rα 复合物（IL-15RF）——一种改善 NK 细胞存活的策略

IL-15 是调节 NK 细胞存活和功能特征的最重要因子之一。它是一种分子量为 14-15 kDa 的细胞因子。已经发现，IL15、IL15RA 或 IL2RB（编码 IL-15 受体的 β - 亚基 - IL-15Rβ）基因敲低会导致 NK 细胞发育完全停止，并且它们无法从 CD56bright 表型分化为 CD56dim 表型。该数据证明了 IL-15 在调节 NK 细胞所有发育阶段（从前体早期到成熟细胞）的关键作用。IL-15 由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞与 IL-15Ra 受体亚基一起产生。它通过反式呈递呈递给 T 细胞和 NK 细胞。当 IL-15 结合到抗原呈递细胞表面的 IL-15Ra 受体亚基时，它与靶细胞表面的 IL-2/15R 受体的 β 和 γ 亚基相互作用，形成配体-受体复合物。这导致 STAT3 和 STAT5 转录因子的激活，以及 PI3K/AKT/mTOR 和 RAS/RAF/MAPK 信号通路的激活。从而对靶细胞产生免疫刺激作用。此外，T 细胞和 NK 细胞能够以顺式方式呈递 IL-15（图2）。IL-15 和 IL-15Ra 受体亚基以及 IL-2/15R β 和 IL-2/15Ry 受体亚基在同一细胞中表达。因此，IL-15 与其合成它的细胞相互作用，有助于其激活和成熟。IL-15 可以以三种形式存在：作为分泌的可溶性单体；作为非细胞性的、同样被分泌的 IL-15/IL-15Ra 复合物；以及膜结合形式的 IL-15/IL-15Ra（mbIL-15/IL-15Ra）。对免疫细胞激活最有效的作用是通过 mbIL-15/IL-15Ra 超激动剂实现的。

图2. 显示了 IL-15/IL-15Ra 结构及其对 NK 细胞的顺式呈递，以及由 IL-15 激活的细胞内信号通路。

CAR-NK 细胞疗法有潜力彻底改变癌症治疗。CAR-T 疗法副作用的风险已显著降低，并且该疗法现在不仅可用于血液系统肿瘤，还可用于实体瘤。然而，仍然存在一些限制，例如 CAR-NK 细胞在体内的寿命短及其活力降低，尤其是在肿瘤环境中，这可能导致其杀死癌细胞的能力迅速下降。在这种背景下，进一步用 mbIL-15/IL-15Ra 超激动剂修饰 CAR-NK 细胞可以克服这些限制并改善移植后的存活能力。

根据研究，向患者施用分泌的可溶性 IL-15 单体和不相关的 IL-15/IL-15Ra 复合物可以导致免疫细胞的抗肿瘤刺激和增殖。然而，这种治疗存在严重副作用的风险，因为 IL-15 本身与慢性炎症性疾病的发展和自身免疫反应有关。单体形式的外源性 IL-15 可导致癌症患者低血压、血小板减少症、肝损伤和败血症。长期接触 IL-15 可能导致 CAR 细胞过度激活及其过早耗竭。小鼠实验研究发现，施用 IL-15 会引起中性粒细胞减少症和淋巴细胞白血病。此外，在这些动物中，施用 IL-15/IL-15Rα 复合物与体温过低和脾肿大有关。

重要的是要注意，IL-15 与 IL-15Rα 结合将产生比未适当呈递的 IL-15 更有效的反应。mbIL15/IL15-Rα 复合物的创建是通过连接子序列将 IL-15 人工"绑定"到 IL-15Rα 上实现的。IL-15Rα 结构中确定了五个结构域：寿司结构域，IL-15 以高亲和力与之结合；连接子结构域；富含脯氨酸/苏氨酸的结构域；跨膜结构域；以及细胞质结构域。研究发现，通过连接子序列连接到 IL-15Rα 寿司结构域的 IL-15 复合物（IL-15/寿司 IL-15Rα）保留了与整个 IL-15/IL-15Rα 复合物相同的免疫刺激作用。几项研究证明了 mbIL-15/IL-15Rα 在 CAR-T 和 CAR-NK 治疗血液系统肿瘤和实体瘤中的有益作用。与抗 CD19-CAR-T 细胞相比，抗 CD19-mbIL15/IL15Rα-CAR-T 细胞表现出更高的抗肿瘤活性和增殖能力，从而改善了实验小鼠的存活率。在另一项研究中，研究人员比较了抗 MSLN-CAR-T 细胞与抗 MSLN-mbIL15/IL15Rα-CAR-T 细胞。他们发现后者在体内具有更大的抗肿瘤细胞毒性，具有更高的增殖率，并且在体外没有 IL-2 的情况下可以存活更长时间。然而，在研究抗 CD19-mbIL15/IL15Rα-CAR-T 细胞时，也观察到这种疗法的一些不良反应。具体来说，用这些细胞治疗的小鼠出现了脾肿大和 T 细胞克隆的异常增殖。当给小鼠施用常规的抗 CD19 CAR-T 细胞时，没有观察到这些效应。

关于 CAR-NK 细胞，体外研究发现，与抗 CD19-CAR-NK 细胞相比，抗 CD19-mbIL15/IL15Ra-CAR-NK 细胞在没有 IL-2 的情况下可以存活培养 21 天，而常规的抗 CD19-CAR-NK 细胞增殖至培养 12 天。在体内，这些细胞具有更大的抗肿瘤活性，并提高了实验小鼠的存活率。还注意到，分泌形式的 IL-15 可以在体内维持 CD123/BCMA-CAR-NK 细胞持续存在 40-50 天。

补充了 mbIL-15/IL-15Rα 的 CAR-NK 细胞在临床前研究中显示出优异的结果，优于常规的 CAR-NK 细胞。目前正在进行临床试验，研究 mbIL15/IL15Rα-CAR-NK 细胞对癌症患者不同类型肿瘤的影响（NCT06652243，NCT06342986，NCT05182073）。

3.4. 免疫检查点抑制作为增加细胞毒性和 NK 细胞存活的策略

为了在增强抗肿瘤细胞毒性和寿命方面取得最佳效果，可以抑制 NK 细胞中某些基因的表达。正确靶点的选择取决于几个因素。例如，可以敲除或敲低一些免疫检查点，肿瘤通过这些检查点抑制 CAR-NK 细胞的功能活性。NKG2A 受体就是这样一个例子。通过使用治疗性抗体达雷妥尤单抗，可以增加 CAR-NK 细胞免疫疗法的有效性。达雷妥尤单抗是一种 FDA 批准的抗 CD38 治疗性单克隆抗体。为了防止在达雷妥尤单抗治疗期间 CAR-NK 细胞的"友军误伤"，除了 CAR 外，还在 NK 细胞中进行 CD38 基因敲除。至少已经启动了一项临床试验，研究结合 CD38 敲除的 CAR-NK 细胞与达雷妥尤单抗的有效性（NCT05182073）。

AHR（芳烃受体）是一种转录因子，在 NK 细胞的正常功能和维持中起双重作用。它调节大量基因的表达，通过 STAT3 转录因子的作用确保形成 CD56bright NK 细胞群体。然而，肿瘤微环境中产生的 AHR 激动剂可以降低 NK 细胞的抗肿瘤细胞毒性，并激活负责氧化应激的基因表达。体外测试表明，敲除 4 个基因 - AHR、CISH、TIGIT 和 PDCD1 - 与只敲除 3 个基因 - CISH、TIGIT 和 PDCD1 相比，并未导致抗肿瘤细胞毒性的增加。然而，与没有遗传修饰的 NK 细胞对照组相比，敲除了 AHR、TIGIT 和 PDCD1 基因的 NK 细胞组和额外敲除了 CISH 基因的组（总共 4 个基因）都显示出更高的抗肿瘤细胞毒性。

CISH（细胞因子诱导的含 SH2 结构域的蛋白）是属于 SOCS（细胞因子信号传导抑制因子）家族的蛋白。它是 NK 细胞中由 IL-15 触发的 STAT5 信号通路的负调控因子。通过与细胞因子受体胞内域中磷酸化的酪氨酸结合，CISH 通过破坏信号级联来阻止进一步的信号传递。它还可以通过与 E3 泛素连接酶相互作用，将其相互作用的蛋白导向蛋白酶体降解。研究发现 CISH 阳性 NK 细胞、IL-10 和 GRP78 的水平与卵巢癌的发展之间存在相关性。这表明 CISH 可以被视为 NK 细胞耗竭的标志物。许多研究也注意到了 CISH 基因敲除在 NK 细胞中的积极作用。这导致与 IL-15 相互作用时 JAK-STAT 信号通路的稳定性，从而导致 NK 细胞更好的存活和更长的存留，以及在体外和体内更好的抗肿瘤细胞毒性活性。已经注意到，具有 CISH 敲除的 NK 细胞在体内小鼠模型中抑制肿瘤转移。综上所述，现有数据表明 CISH 基因是 NK 细胞中一个有吸引力的敲除/敲低靶点。

NK 细胞的重要免疫检查点是 TIGIT 和 CD96 受体。这些受体的配体是 CD155 蛋白，该蛋白在各种类型的恶性肿瘤中表达水平更高。TIGIT 对 CD155 具有更强的亲和力，其次是 CD96 的结合强度。由于 TIGIT 只包含抑制性的 ITIM 基序，与不仅携带 ITIM 还携带 YXXM 基序（在某些条件下可导致细胞激活）的 CD96 相比，它对 NK 细胞活性的抑制性影响更强。浸润肿瘤的 NK 细胞中 TIGIT 表达增加与转移风险增加和不良预后相关。在研究中，TIGIT 和 CD96 敲除导致 NK 细胞毒性增加和肿瘤转移抑制。Harjunpaa 等人进行了一项小鼠研究，比较了 PDCD1（编码 PD-1）和 CD96 敲除组与 TIGIT 和 CD96 敲除组。结果显示，去除 PDCD1 和 CD96 显著有助于抑制肿瘤生长，导致完全缓解。另一项研究的结果表明，同时敲除三个基因（TIGIT、PDCD1 和 CISH）的自然杀伤（NK）细胞比敲除两个基因（TIGIT 和 PDCD1）具有更好的抗肿瘤细胞毒性。这也与敲除另外三个基因（TIGIT、PDCD1 和 AHR）以及敲除四个基因（TIGIT、PDCD1、AHR 和 CISH）进行了比较。在同一研究中，接受表达可溶性形式 IL-15 并敲除 TIGIT、PDCD1 和 CISH 的抗 CD19-CAR-NK 细胞的小鼠，与其他三组相比，具有更好的抗肿瘤活性指标和更长的存活期：抗 CD19-CAR-NK、表达 IL-15 的抗 CD19-CAR-NK 以及仅敲除 TIGIT、PDCD1 和 CISH 的抗 CD19-CAR。

现代研究中的许多注意力集中在 NK 细胞抑制性受体 NKG2A（CD159a）上。该受体的配体是 HLA-E 分子，一些肿瘤细胞大量表达该分子以逃避免疫系统的监视。NKG2A 由 KLRC1 基因编码，在 NK 细胞和 CD8+ 淋巴细胞中，它以与 CD94 受体形成的异源二聚体形式定位于细胞膜上。正常细胞表面有限的 HLA-E 有助于它们避免自身免疫反应；然而，在肿瘤细胞中，由于 HLA-E 的增加，NK 细胞的细胞毒性被抑制。这种增加与不良生存预后相关。此外，浸润肿瘤的 NK 细胞表达 NKG2A 的水平远高于正常 NK 细胞，这是由于肿瘤微环境中因子和各种细胞因子如 IL-21、IL-12、IL-10 和 TGF-β（转化生长因子 beta）的影响。当 NKG2A 与其配体结合时，其两个细胞内 ITIM 域被磷酸化。这吸引了 SHP 磷酸酶，触发级联反应，抑制 NK 细胞的细胞毒性。在许多实验研究中，已注意到抑制 NKG2A 的功能活性可提高 NK 细胞的抗肿瘤细胞毒性。研究表明，使用 CRISPR/Cas9 系统进行 NKG2A 基因敲除似乎比使用针对 NKG2A 的治疗性抗体更有效。然而，最近的一项研究表明，NKG2A 有助于维持 NK 细胞的增殖能力并保护它们免于凋亡。因此，对 NK 细胞中 NKG2A 基因敲除应谨慎对待。

PD-1 是由 PDCD1 基因编码的一种蛋白，以其在 T 淋巴细胞中的免疫抑制功能而闻名。它与配体 PD-L1 结合，PD-L1 在某些类型的肿瘤细胞中高表达。这导致 T 淋巴细胞功能失能的发展。PD-1 的免疫抑制效应是由于存在抑制性 ITIM 域。当受体与其配体相互作用时，该域被磷酸化。这种相互作用吸引酪氨酸磷酸酶 SHP-2，该酶使 T 淋巴细胞中与 TCR 相关的 CD3 共受体和 ZAP70 酪氨酸激酶去磷酸化。这阻止了来自 TCR 的激活信号的传递。关于 PD-1 在 NK 细胞上的表达存在矛盾的数据。通常认为健康个体的 NK 细胞不表达 PD-1。然而，研究表明，患有某些肿瘤类型和某些病毒感染的患者可能具有表达 PD-1 的 NK 细胞。这些情况包括多发性骨髓瘤、肾细胞癌、卡波西肉瘤、卵巢癌、霍奇金淋巴瘤、消化系统肿瘤、非小细胞肺癌，以及巨细胞病毒或 HIV 感染患者。很可能，在其他感染性和肿瘤性疾病的发展过程中也可能发现 PD-1 阳性 NK 细胞。还有证据表明，NK 细胞可以通过一种称为胞葬作用的过程从肿瘤细胞表面获取 PD-1。同时，NK 细胞自身表达 PD-1 主要见于高度分化的 CD56dim、CD57 阳性 NK 细胞群体。这些 PD-1 阳性 NK 细胞还具有低水平的激活受体表达，如 NKG2D、NKp30、NKp46 和 DNAM-1，并且 IFNγ、TNF-α 和颗粒酶的分泌减少。FDA 已批准 PD-1 免疫检查点抑制剂（一种单克隆抗体）用于治疗几种类型的肿瘤。

LAG3（淋巴细胞激活基因 3，也称为 CD223）是 NK 细胞和 T 细胞表达的一种蛋白。其生物学功能是通过抑制 STAT1/IFNγ 分子通路来抑制 IFNγ 的表达。它还通过抑制 PI3K/AKT/mTOR 通路破坏糖酵解过程，并通过抑制 TCR 来抑制 T 细胞激活。LAG3 的配体包括 MHC II 类分子、半乳糖凝集素-3、L-选择素、α-突触核蛋白、FGL3 和 TCR/CD3 复合物。在病毒性疾病的发展过程中观察到 NK 细胞和 T 细胞上 LAG3 表达增加。特别是，LAG3-high NK 细胞在 HIV 感染者以及肿瘤性疾病患者中发现，这与不良生存预后相关。LAG3 以及其他免疫检查点分子的表达在肿瘤浸润淋巴细胞中尤其强烈增加。在滤泡性淋巴瘤中，观察到 T 细胞上 LAG3 与 TIM3 和 PD-1 的共表达增加。据报道，当 LAG3 被抑制时，PD-1 蛋白基因的表达增加。这导致得出结论，联合阻断多个免疫检查点可能具有潜在优势。临床前研究和临床试验已证实抑制 LAG3 对淋巴细胞的积极作用。

关于所列免疫检查点的一些额外数据和其他相关信息见表2。需要注意两点：首先，目前 FDA 批准的免疫检查点抑制剂药物是单克隆抗体；其次，截至 2025 年，没有任何获批的 CAR-细胞疗法涉及免疫检查点的敲除。

表2. NK 细胞免疫检查点。

3.5. 安全开关

CAR 细胞免疫疗法尽管有许多优点，但确实有一些局限性。其中一个局限性是 CAR-T 细胞疗法在临床试验中已证明的潜在毒性，以及 CAR-NK 细胞制剂的潜在毒性。另一个局限性是在用携带 CAR 的载体转导免疫细胞过程中插入突变和致癌转化的风险。为确保患者安全，一种解决方案是使用诱导细胞凋亡的蛋白开关分子完全消除 CAR 细胞。有几种人工诱导细胞凋亡的方法，包括使用诱导促凋亡蛋白二聚化的化学物质、更昔洛韦与 HSV-TK（单纯疱疹病毒胸苷激酶）的相互作用，以及基于抗体依赖性细胞毒性的方法。

第一种方法基于使用一种称为诱导型 caspase 9（iCasp9）的修饰版 caspase 9，在引入特定化学诱导剂后可通过同源二聚化激活。Caspase 9 是启动凋亡（导致程序性细胞死亡的过程）的关键酶。它具有蛋白水解功能，可触发线粒体（内源性）凋亡通路。iCasp9 基因包含人 caspase 9 的序列（不含天然激活域 CARD）和人蛋白 FKBP 的序列。当此序列与 FK1012（由两个他克莫司分子（FK506）组成的分子）相互作用时，可以形成二聚体。这种二聚化的化学诱导剂包括 AP20187 和 AP1903（或 rimiducid）药物。这些诱导剂的分子结构与 FK1012 几乎相同。当施用 AP1903 或 AP20187 时，它们与 iCasp9 相互作用并使其形成二聚体，从而触发细胞凋亡。这种方法的优点包括高效消除靶细胞（超过 90%）和快速的细胞清除速率（半小时内）。另一个好处是所施用药物的选择性效应，这些药物仅与特定的 FKBP 序列相互作用。然而，这种方法也有一些缺点。AP20187 和 AP1903 尚未被批准用于临床，因此无法广泛使用。可能很快会有大量显示阳性结果的临床试验改变这种情况（NCT03056339，NCT05020015，NCT00710892，NCT01494103，ACTRN12614000290695）。

第二种方法基于更昔洛韦与 1 型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）的相互作用。当生产基因修饰的嵌合抗原受体（CAR）细胞时，将 HSV-TK 基因引入其中。该基因通常不存在于人类细胞中，因此当患者接受更昔洛韦治疗时，它会选择性消除表达 HSV-TK 的 CAR 细胞。在 HSV-TK 的作用下，更昔洛韦转化为有毒代谢物，导致 CAR 细胞凋亡。临床试验已显示这种方法在消除 HSV-TK 阳性细胞方面的前景。然而，HSV-TK 也可能在体内引起免疫反应。这种方法的另一个局限性是消除 HSV-TK 细胞所需的时间相对较长，大约三天，而使用 iCasp9 仅需半小时。

第三种方法基于 NK 细胞在与此类细胞表面基因修饰蛋白结合的抗体相互作用后，诱导靶向细胞发生抗体依赖性细胞死亡的能力。为解决此问题，将截短的表皮生长因子受体（tEGFR）（NCT03084380，NCT05141253，NCT05166070）或 RQR8（一种由两个表位（CD20 和 CD34）组成的蛋白）（NCT05211557）的基因引入细胞。由于删除了细胞内信号域，这些人工蛋白无法在细胞中触发信号级联。然而，tEGFR 和 RQR8 中抗体结合表位的保留允许将它们用作转导细胞的标志物。这使得不仅可以特异性消除"标记的"细胞，还可以进行细胞分选。这种方法的优点包括有机会使用临床批准的抗体，如用于 tEGFR 的西妥昔单抗或用于 RQR8 中 CD20 表位的利妥昔单抗。引入细胞的构建体不会引起免疫原性，并且消除速率和效率高，超过 80% 的细胞被消除。这种方法的缺点包括：首先，对于在 CAR-T 治疗前接受过淋巴细胞清除治疗的患者，其效果可能有限，因为这可能会降低 NK 细胞的功能活性。其次，存在抗体与 EGFR 或 CD20 发生脱靶效应的交叉反应风险，导致患者健康细胞被消除。

4. CAR-NK 细胞产品的现代临床试验

基因修饰的 NK 细胞是癌症免疫治疗的有前景工具。对这一领域开发的兴趣、该领域的前景以及在 ClinicalTrials.gov 上注册的临床试验数量都是相互关联的。截至 2025 年 9 月，已有超过 100 项临床试验注册，研究基因修饰 NK 细胞疗法在消除各种类型肿瘤方面的有效性。在大多数情况下，CAR-NK 细胞是研究对象，并且这些主要是第一阶段试验。少数试验处于第二阶段。与 CAR-T 一样，B 细胞淋巴瘤和急性髓系白血病等血液系统恶性肿瘤仍然是探索 CAR-NK 细胞抗癌治疗潜力的主要焦点。然而，大量 CAR-NK 细胞的临床试验专注于评估其对各种实体瘤类型的有效性，包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌等。这些试验均在 ClinicalTrials.gov 上注册。涉及基因修饰 NK 细胞的试验可大致分为几类（见表3）：

使用"经典" CAR 结构的一组临床试验。在这种 CAR 中，抗原识别域源自针对特定靶点的抗体。该域包含一个单链可变片段（scFv），该片段基于抗体的可变轻链（VL）和可变重链（VH）。这些类型的 CAR 靶向特定抗原（NCT06454890，NCT06690827）；

使用非标准 CAR 结构的一组临床试验。在这种情况下，抗原识别域由激活的 NK 细胞受体的序列代表。例如，NKG2D 片段比其他更常用。这种类型的 CAR 用途广泛，可应用于各种疾病（NCT05247957，NCT05213195）。

采用 CAR-NK 细胞设计特定方法的一组试验：

同时靶向两个抗原的双特异性 CAR（biCAR）（NCT03931720；NCT06594211）。

涉及同时表达几种蛋白结构的 NK 细胞修饰。例如，一种"经典" CAR 针对特定抗原，同时合成额外的蛋白。这种方法用于 NCT05987696 试验，其中辅助蛋白是趋化因子 CCL1，它将其他免疫细胞吸引到感染部位。

没有 CAR 但带有其他基因修饰（如基因敲除）的 NK 细胞（NCT04991870）。

表3. 使用基因修饰 NK 细胞治疗癌症的临床试验。

通常选择患有 B 细胞非霍奇金淋巴瘤、B 淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和 T 细胞白血病/淋巴瘤的患者接受 CAR-NK 细胞治疗血液系统恶性肿瘤。CD19、CD22、BCMA、CD70、CD123 和 CD33 是这些治疗最常见的靶点（表4）。针对实体瘤的 CAR-NK 疗法临床试验较少。卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌和肝细胞癌是 CAR-NK 细胞疗法中最常研究的实体瘤。MUC1、CD70、TROP2、MICA/B、GPC3 和 Claudins 是设计用于实体瘤的 CAR-NK 细胞的常见靶点。

表4. 靶向肿瘤抗原及相关临床试验。

CAR-NK 细胞疗法是一种有前景的癌症治疗方法。它的发展始于使用自体 NK 细胞的高剂量疗法和"经典" CAR-NK 细胞的创建。如今，它正朝着开发第四代 CAR-NK 细胞的方向继续发展，这些细胞不仅经过 CAR 修饰，还经过其他蛋白结构的基因修饰。这些细胞具有多种功能：表现出强大的抗肿瘤毒性，激活患者的免疫系统，维持自身功能，并且对患者安全。对 CAR-NK 细胞基因修饰的分析允许确定几种可以提高这些细胞抗肿瘤活性的方法：

首先，选择合适的肿瘤靶点。理想情况下，该靶点不应由正常细胞表达。然而，实际上，最佳选择是那些在健康细胞中表达低、在肿瘤细胞中表达高的靶点。其次，正确的 CAR 设计，最佳细胞内结构域的选择，取决于设定的任务。第三，将具有细胞内结构域的高亲和力、不可切割 CD16 分子引入 CAR-NK 细胞，将允许在患者治疗中联合使用治疗性抗体和 CAR-NK 疗法。这将通过 CD16 分子产生的强大细胞内信号提供ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）的抗肿瘤活性（图3）。

图3. 具有高抗肿瘤细胞毒性、能够长期维持功能活性且对患者安全的下一代 CAR-NK 细胞。

通过将与其 IL-15Rα 受体结合的 IL-15 引入 CAR-NK 细胞，可以实现更好的增殖活性和存活。由于其顺式呈递，IL-15/IL-15Rα 确保了 CAR-NK 细胞的持续自我激活。

抑制免疫检查点同时执行两种功能：它增强抗肿瘤细胞毒性并改善 CAR-NK 细胞的存活，因为肿瘤细胞能够通过这些检查点负向调节这些细胞的功能活性。

通过将称为"开关"的遗传序列整合到这些细胞中，确保了 CAR-NK 细胞对患者的安全性。这些开关允许在必要时快速消除 CAR-NK 细胞。

5. 抗肿瘤 CAR-NK 疗法的优化

NK 细胞在静息状态下对葡萄糖的需求较低，因此其糖酵解和氧化磷酸化过程减慢。然而，当它们被细胞因子激活时，葡萄糖消耗水平显著增加，特别是通过增加 GLUT1 蛋白（葡萄糖转运蛋白成员 1）的合成来强化糖酵解和氧化磷酸化过程。因此，NK 细胞的效应活性增加。然而，当 NK 细胞进入肿瘤微环境（TME）时，它们会遇到由于存在细胞毒性代谢产物、缺氧和肿瘤相关免疫细胞（MDSC、M2 巨噬细胞）以及其他因素而产生的毒性效应。存在营养竞争，因为肿瘤细胞消耗大量葡萄糖和氨基酸。实体瘤 TME 的特点是精氨酸和亮氨酸浓度降低，以及存在色氨酸代谢产物 L-犬尿氨酸和氮氧化物，这些是精氨酸分解代谢的产物。所有上述因素导致 NK 细胞代谢过程的变化，这反过来导致其效应功能和增殖活性恶化。这还导致 ADCC 机制抑制和 IFN-γ 合成减少。高水平的腺苷、HIF-1α 和乳酸导致氧化磷酸化和糖酵解减少，以及激活受体如 NKp30、NKp46 和 NKG2D 的表达降低。此外，它还导致 IFN-γ 和颗粒酶 B 的产生减少，并抑制转录因子 SREBP 的活性。因此，优化 CAR-NK 细胞的代谢功能对于更好地消除实体瘤细胞至关重要。实验研究表明，当给感染巨细胞病毒的小鼠施用糖酵解抑制剂 2-脱氧葡萄糖时，会观察到 NK 细胞毒性降低以及从体内清除病毒的能力受损。这是由于糖酵解和氧化磷酸化过程受损。此外，如果给小鼠注射 IL-15 ALT803 超激动剂（IL-15 超激动剂 ALT-803）和 2-脱氧葡萄糖，它会增强糖酵解活性、氧化磷酸化和 NK 细胞的增殖。到第 10 天，100% 的小鼠存活，与未用 ALT803 治疗的小鼠不同。在另一项研究中，研究人员发现，CAR-NK 细胞的代谢特性可以通过将从血液中分离出的 NK 细胞与细胞因子和基因修饰的饲养细胞（如 K562 或 721.221）进行预培养来优化。特别是，当 NK 细胞在存在 IL-2、IL-15 和 mbIL-21-721.221 饲养细胞系的情况下培养时，可以生成在体外和体内均具有高抗肿瘤活性的抗 CD19-CAR-NK 细胞。这是通过上调参与氨基酸代谢和糖酵解的基因表达实现的，例如 FN3K（果糖胺-3-激酶）、PEMT（磷脂酰乙醇胺 N-甲基转移酶）、MARS（甲硫氨酰-tRNA 合成酶 1）和 GPT2（谷丙转氨酶 2）。已显示，联合抗肿瘤治疗与 CAR-NK 细胞治疗可以促进这些细胞更好的代谢活性。标准治疗可导致肿瘤质量减少，从而减少肿瘤细胞对葡萄糖的竞争性消耗。这使得 CAR-NK 细胞可以消耗更多的葡萄糖，增强其抗肿瘤和溶细胞功能。

尽管 CAR-NK 细胞疗法有许多优点，但这种治疗方法仍面临一些挑战。主要挑战之一是肿瘤细胞在 NK 细胞移植后的免疫监视逃避及其对免疫细胞的抑制作用。此外，NK 细胞在体内扩增能力低以及免疫抑制性肿瘤微环境的影响导致 NK 细胞表面受体平衡从激活受体向抑制受体倾斜。

如今，研究人员正在考虑各种联合治疗方法以克服这些局限性。其中包括使用免疫检查点抑制剂（阿特珠单抗、纳武利尤单抗和帕博利珠单抗）、顺铂、放射治疗（使用 125I 粒子的近距离放射治疗）、酪氨酸激酶抑制剂（瑞戈非尼、索拉非尼和卡博替尼）、蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）、STING 通路激动剂（cGAMP）、溶瘤病毒、单克隆抗体和光热疗法。目前正在研究许多方法，包括体外和体内。临床试验也已开始。因此，在 2021 年，开始了一项 II 期临床试验，评估同种异体 γ 辐照的抗 PD-L1 CAR-NK 细胞联合 PD-1 抑制剂帕博利珠单抗和 IL-15 受体激动剂 N-803 治疗复发性或转移性胃癌或头颈肿瘤患者的有效性（NCT04847466）。尽管研究结果尚未发表，但联合使用各种类型的 CAR-NK 细胞与 PD-1 抑制剂的有效性已在临床前研究中通过体外和体内模型多次证明。PD-1 单克隆抗体已被证明可以增强 NK 细胞的抗肿瘤作用，并在顺铂耐药肺癌模型中增加其细胞毒性。在另一项探索性研究中对经过大量预处理的转移性结直肠癌患者进行的探索性研究中，观察到联合治疗的临床益处出现在一组接受 NKG2D CAR-NK 细胞联合抗 PD-1 治疗的三名患者中。三名患者中的一名实现了疾病稳定，两名患者的总生存期超过 700 天。在未接受抗 PD-1 治疗的患者组中，结果不太理想：两名患者在接受 CAR-NK 细胞注射后不同时间死亡（死亡与治疗无关），第三名患者监测了大约 300 天后停止监测。在另一项研究中，对一种靶向 ROR1 阳性胶质母细胞瘤细胞并在其中激活 IL-21 分泌的 C021 溶瘤病毒与抗 ROR1-CAR-NK 细胞联合使用的可能性和有效性进行了体外和体内评估。IL-21 是一种在调节 NK 细胞功能（包括其激活和增殖）中起作用的细胞因子。实验证明，IL-21 增强 NK 细胞的激活，并促进 NK 细胞分泌其他细胞因子，如 IFN-γ。该研究的作者在体内证明了该病毒感染神经母细胞瘤细胞系 CHLA-255 和 SKNFI 的能力。他们发现该病毒显著降低了这些细胞的活力，并增加了存活细胞中的 IL-21 产量。当将病毒添加到 NK 细胞时，未观察到这种效应。在细胞毒性实验中，作者证明，溶瘤病毒和抗 ROR1-CAR-NK 细胞的组合显著增强了后者对 SKNFI 神经母细胞瘤细胞的细胞毒性作用。此外，溶瘤病毒和抗 ROR1-CAR-NK 细胞的组合显著提高了携带人神经母细胞瘤异种移植物的 NSG 小鼠的存活率，证明了这种组合在体内的有效性。因此，使用溶瘤病毒可以同时实现两个目标：增强 CAR-NK 细胞的激活和增殖，以及额外破坏肿瘤细胞。

在选择治疗方案时，也可以考虑患者肿瘤的个体特征。例如，对编码 EGFR（表皮生长因子受体）的基因发生突变的非小细胞肺癌患者，可能会给予酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗。然而，TKI 治疗后，一些患者会保留对药物耐受的细胞，这随后可能导致完全治疗耐药细胞的发展。为了避免这种情况，已经提出了 TKI 联合抗 EGFR CAR-T 或 CAR-NK 细胞的方案，这些细胞可以有效破坏 EGFR 阳性肿瘤细胞。随着长期 TKI 治疗，治疗耐药细胞表面的 EGFR 分子数量增加，联合抗 EGFR-CAR 细胞可以帮助靶向这些细胞。TKI 联合抗 EGFR-CAR-NK 细胞已被证明在体外和体内有效。

因此，联合治疗同时考虑了患者和肿瘤的个体特征，以及 CAR-NK 细胞的生物学特性。这允许采用不同的方法来提高抗肿瘤治疗的有效性。

6. 结论

CAR-NK 细胞疗法的未来在于开发一种高效且多功能的"通用"细胞。这种细胞应同时具备以下特征：

(1) 强大且多功能的抗肿瘤活性
(2) 在体内的持久存在
(3) 无可挑剔的安全性。

与 CAR-T 细胞相比，CAR-NK 细胞有几个优点。例如，它们不会引起副作用，并且较少依赖单一靶抗原。与 CAR-T 细胞相反，CAR-NK 细胞保持了其天然受体（NKG2D、DNAM-1 和 NCRs）的活性。这使得即使靶抗原丢失，它们也能攻击肿瘤，显著降低肿瘤复发风险。这使得 NK 细胞成为过继性细胞免疫治疗的有前景模型。它们的一些局限性可以通过精心选择的遗传修饰组合轻松克服。为确保 NK 细胞在没有外部细胞因子支持下的长期存活，积极采用内部细胞因子产生的策略，例如通过表达膜结合 IL-15/IL15Ra。为了提高安全性，通过引入"分子开关"基因对细胞进行修饰。这种高抗肿瘤活性不仅通过 CAR 实现，还通过具有细胞内激活域的高亲和力不可切割 CD16 实现。此外，可以对细胞进行修饰，使其对 TGF-β 或缺氧产生抵抗，从而抵抗肿瘤微环境（TME）的免疫抑制效应。尽管尚未有 CAR-NK 药物获得 FDA 或 EMA 批准，但众多 I/II 期临床试验已取得令人鼓舞的结果，不仅针对血液系统恶性肿瘤，也针对实体瘤。NK 细胞来源的多样性、从 iPSCs 标准化生产它们的能力，以及积极的临床数据的积累，使人们希望首个 CAR-NK 产品可能在不久的将来获得批准，开启一个更安全、更易获取的过继性细胞治疗新时代。