2025年11月26日发表于npj precision oncology

摘要

KRAS基因突变发生于超过三分之一的结直肠癌（CRC）中，主要影响12和13号密码子，较少见于61、117和146号密码子。其他密码子的罕见突变也有报道，但通常缺乏明确的功能意义。这些突变激活驱动细胞增殖、抑制细胞分化和凋亡的信号通路。KRAS突变型CRC预后较差、复发率较高、化疗反应降低以及对EGFR靶向治疗耐药。目前，根据KRAS突变状态对患者进行分层已成为指导治疗的标准方法，但并非所有突变都具有相同的致癌性或治疗反应。KRAS突变曾被认为无法成药，但近年来，针对特定KRAS突变亚型的抑制剂的研发取得了进展。因此，精确表征KRAS突变谱对于优化CRC的治疗策略至关重要。本研究对KRAS突变频率和共现情况进行了系统分析，回顾了当前的靶向治疗，并考察了针对CRC中最常见的KRAS改变的正在进行的临床试验。

介绍

结直肠癌（CRC）是第三大常见癌症和第二大癌症致死率，全球每年新增病例近200万例，死亡人数近100万。大多数结直肠癌的发生是一个循序渐进的过程，由控制细胞分裂的基因突变引发，导致细胞不受控制地增殖并形成良性息肉。这些病变可通过获得额外的基因组改变而进展为恶性肿瘤，这些改变包括染色体异常、基因突变以及调控增殖、分化、凋亡和血管生成的基因的表观遗传修饰。

结直肠癌（CRC）是一组具有不同突变谱和表型特征的异质性肿瘤。自20世纪90年代初发现突变表型以来，临床上将CRC分为两大类：微卫星稳定型（MSS）肿瘤，其错配修复系统功能正常（pMMR）；以及微卫星不稳定性（MSI）肿瘤，其错配修复系统存在缺陷（dMMR），导致显著的突变表型，主要靶向微卫星序列。这种分类对于理解CRC的病因和生物学以及临床治疗至关重要。

2012年，癌症基因组图谱（TCGA）联盟发表了一项关于结直肠癌（CRC）的综合分子分析，根据体细胞突变率将肿瘤分为两大类：非高突变肿瘤（主要为微卫星稳定型，MSS）和高突变肿瘤，后者主要包括微卫星不稳定性（MSI）肿瘤和携带DNA聚合酶ε基因（POLE ）突变的肿瘤。TCGA研究总结了数十年的研究成果，为CRC的分子异质性以及高突变（MSI和POLE）与非高突变癌症的显著差异提供了强有力的证据 。2015年，基于转录组分析的包含四种分子亚型的替代分类系统被提出。虽然这种基于转录组的分类与肿瘤特征和患者预后相关，但尚未在临床实践中得到广泛应用。

Ras蛋白是小GTP酶，作为分子开关激活调控细胞生长、分化和凋亡的基本信号转导通路。人类拥有三个RAS基因——HRAS、KRAS和NRAS——编码四种蛋白质（KRAS编码两种剪接变体，KRAS4A和KRAS4B），这些蛋白质序列高度相似。尽管如此，RAS亚型在组织分布、膜定位和下游信号传导偏好方面存在差异，导致不同肿瘤类型中突变谱和致癌作用的差异。

RAS蛋白在活性GTP结合状态和非活性GDP结合状态之间循环。生长因子与膜结合受体相互作用刺激RAS蛋白，激活RAS蛋白，进而通过GRB2和SOS（一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，GEF）进行信号转导，GRB2和SOS催化GDP-GTP交换并激活RAS蛋白。这种构象变化被RAS效应蛋白检测到，激活下游信号通路，最显著的是RAF/MEK/ERK（MAPK通路）和PI3K/AKT/mTOR（PI3K通路），从而调节细胞凋亡抑制、细胞生长、转化、迁移和分化。RAS蛋白通过GTP水解为GDP而失活，该过程由RAS蛋白的固有GTP酶活性催化，并被GTP酶激活蛋白（GAP）加速。最主要的RAS GAP是神经纤维蛋白1（NF1）和RASA1（也称为p120GAP）。

RAS基因的突变频率和谱系因癌症类型和基因类型而异，这表明并非所有RAS突变都相同，特定突变表现出独特的生物学和临床行为。驱动RAS基因中特定突变占据主导地位的因素是多种因素复杂相互作用的结果，包括组织特异性因素，例如基因毒性应激、生物选择、基因组拓扑结构、基因表达和细胞环境。最常见的癌症相关Ras改变是错义突变，这些突变破坏了非活性形式和活性形式之间的平衡，通常涉及氨基酸替换，从而降低GTP水解或增加GTP结合。密码子12、13、61和146处的突变会破坏GAP介导的GTP水解，导致Ras持续激活和下游信号传导，从而促进细胞存活和不受控制的增殖。突变氨基酸决定了突变型KRAS的生化活性和转化能力。携带不同KRAS突变的细胞在糖酵解、谷氨酰胺利用以及氨基酸、胆碱和核苷酸己糖胺代谢方面也存在差异，这可能影响对抗癌治疗的反应。

靶向MAPK和PI3K通路中KRAS上游和下游蛋白的抑制剂早已获准用于临床。然而，由于KRAS对GTP/GDP具有皮摩尔级的亲和力、细胞内GTP浓度高、缺乏变构调节位点，以及涉及GEF、GAP和效应蛋白的复杂相互作用网络（这些相互作用网络通过延伸的蛋白-蛋白相互作用表面形成），开发特异性KRAS抑制剂面临着巨大的挑战。克服KRAS对GTP的皮摩尔级亲和力需要开发具有卓越结合特性的小分子，其结合特性需远超ATP结合蛋白抑制剂。此外，KRAS突变体中GTP结合口袋的差异也增加了抑制剂设计的难度。由于直接和间接方法屡屡失败，KRAS长期以来被认为是“不可成药的”。索托拉西布和阿达格拉西布（KRAS G12C特异性抑制剂）的开发，将KRAS重新定义为一个具有挑战性但可控的靶点，导致近几年KRAS靶向疗法出现了前所未有的激增。

多年来，抑制KRAS信号传导的新策略不断涌现，主要集中在以下几个方面：(i) 靶向致癌突变型KRAS亚型的抑制剂；(ii) 破坏KRAS-效应蛋白相互作用以阻止下游信号传导；(iii) 抑制KRAS/GEF相互作用以阻止GTP再充电。此外，针对KRAS突变型癌症的疫苗（基于肽和mRNA的疫苗）以及T细胞受体（TCR）工程化T细胞疗法目前正在研发中。

KRAS G12C抑制剂索托拉西布和阿达格拉西布与突变型KRAS的半胱氨酸-12残基共价结合，在经过后期临床开发后，率先获得监管部门批准上市。这些抑制剂阻断KRAS G12C的非活性GDP结合状态，从而阻止SOS催化的核苷酸交换和下游信号传导。然而，它们对野生型或其他活性位点缺乏半胱氨酸的常见KRAS突变体无效。许多具有类似机制的KRAS G12C抑制剂正在进行临床开发。

KRAS G12C抑制剂在携带G12C突变的癌症中取得了显著疗效，但由于它们是专门针对该等位基因设计的，因此对更常见的KRAS突变（例如G12D和G12V）无效。2021年，Wang等人报道了首个KRAS G12D靶向抑制剂MRTX1133，该抑制剂与KRAS的开关II口袋结合，抑制其活性和非活性状态。MRTX1133对KRAS G12D具有高度选择性，并在包括CRC在内的多种体内模型中诱导肿瘤消退。此后，人们开发了许多靶向最常见的G12D和G12V KRAS突变体的分子。

泛RAS抑制剂靶向所有RAS蛋白的野生型和突变型，包括KRAS、NRAS和HRAS，因此具有更广泛的适用性，并且能够在初始KRAS抑制后潜在地阻断KRAS、NRAS或HRAS的代偿性激活或继发性突变。然而，在正常细胞中同时抑制所有三种RAS亚型会带来严重的毒性风险。

泛RAS抑制剂遵循以下几种可能的策略：（i）直接抑制Ras蛋白，例如RMC-6236（daraxonrasib），一种多RAS(ON)抑制剂，能够抑制多种Ras亚型，包括KRAS、NRAS和HRAS的任何突变以及野生型亚型；（ii）通过抑制SOS1驱动的GDP/GTP交换间接靶向Ras，例如BI 1701963。SOS1抑制剂通常与其他KRAS抑制剂联合使用，以抑制反馈再激活并增强反应。

第一代KRAS抑制剂，包括索托拉西布和阿达格拉西布，仅靶向GDP结合的非活性形式（OFF）。使用这些抑制剂治疗通常会触发野生型RAS-GTP的适应性反馈激活或继发突变，从而促进肿瘤持续存在。靶向GTP结合的活性形式的RAS(ON)抑制剂已显示出更优的疗效。Revolution Medicines公司开发了一类RAS(ON)抑制剂，该类抑制剂利用分子伴侣辅助的构象变化，形成可成药的口袋，从而稳定突变型KRAS、分子伴侣蛋白和抑制剂之间的三元复合物。该复合物通过空间位阻阻断KRAS与效应蛋白的相互作用，抑制下游信号传导。这些抑制剂的例子包括RMC-6291（elironrasib，KRAS G12C）、RMC-4998（KRAS G12C）、RMC-9805（zoldonrasib，KRAS G12D）、RMC-5127（KRAS G12V）、RMC-8839（KRAS G13C）和RMC-0708（KRAS Q61H）。此外，RAS(ON)抑制剂，例如RMC-7977和RMC-6236，具有更广泛的活性，可靶向多种突变型和野生型RAS亚型，并克服RAS(OFF)抑制剂常见的耐药性。临床前研究表明，RAS(ON)抑制剂能够持续抑制RAS通路信号传导并延长肿瘤消退时间，而RAS(OFF)抑制剂则常常由于适应性耐药而导致复发。

除了KRAS的药理学抑制外，针对KRAS突变型癌症的免疫治疗方法——包括疫苗和过继性T细胞疗法——目前也正在研发中。靶向KRAS的肽疫苗早在很久以前就已进行过测试，但单个肽通常无法产生足够的表位以充分激活T细胞。靶向KRAS的DNA疫苗也已被探索。近年来，基于个体化mRNA的疫苗接种已应用于KRAS突变型非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）或胰腺腺癌患者。例如，mRNA衍生的KRAS靶向疫苗V941（mRNA-5671）基于脂质纳米颗粒（LNP）制剂的mRNA，可靶向四种最常见的KRAS突变（G12D、G12V、G12C和G13D）。目前，大多数针对KRAS的免疫治疗策略仍处于早期研发阶段，尚无任何一种策略进入临床应用阶段。

针对KRAS突变型转移性结直肠癌（mCRC）的治疗策略正逐渐超越单一KRAS抑制剂。将KRAS抑制剂与抗EGFR疗法或其他靶向药物联合应用已成为一种极具前景的策略，因为与单独使用KRAS抑制剂相比，这种联合疗法能够增强抗肿瘤疗效。该联合策略基于垂直或平行通路阻断的原理：通过同时靶向MAPK信号级联或互补通路中的多个蛋白，可以减少代偿性信号传导，并延缓耐药机制的出现，而耐药机制通常会限制单药治疗的持久性。近期临床前和临床研究已证实，这些联合疗法能够提高KRAS突变型癌症患者的缓解率和无进展生存期。这些观察结果强调了合理联合治疗策略在为这一棘手患者群体开发精准疗法中的重要性。

KRAS靶向治疗在结直肠癌（CRC）中的临床应用价值取决于KRAS突变的具体分布及其与其他基因改变的共存情况。大量文献探讨了CRC中KRAS突变的发生率，其中一些研究分析了非常庞大的样本量。诸如癌症体细胞突变目录（COSMIC）等资源为探索大样本的突变谱提供了宝贵的工具，但由于样本选择和突变检测策略（例如，靶向测序、全外显子组测序或全基因组测序）的差异，汇总研究可能会引入偏差。此外，这些资源并非总能提供影响KRAS突变发生率的关键因素的信息，例如错配修复缺陷或导致高突变表型的POLE突变。

鉴于KRAS突变的多样性及其日益凸显的治疗意义，亟需深入了解其在结直肠癌（CRC）中的发生率、共突变模式以及对靶向治疗的反应。本研究对三个大型CRC队列的KRAS突变谱进行了详细分析，这些队列拥有全面的临床和突变数据，并校正了已知影响KRAS突变发生率的因素。我们还探讨了不同的KRAS突变及其共突变基因如何影响CRC患者的治疗策略，并参考了目前正在进行的KRAS靶向治疗临床试验的最新进展。我们的讨论涵盖了已获批准的治疗方法和正在进行临床研究的疗法。

结果

结直肠癌中RAS突变的发生率

根据COSMIC数据库的数据，KRAS是CRC中最常见的突变癌基因，在起源于大肠的腺癌中发生率高达34%。相比之下，NRAS和HRAS的突变频率要低得多，分别占病例的4%和1%。然而，COSMIC数据库汇集了来自不同研究的数据，这些研究采用不同的患者选择标准和突变分析方法，这可能会导致观察到的突变频率存在偏差。为了更准确地估计RAS突变在结直肠癌 (CRC) 中的频率，我们对来自cBioPortal的最大结直肠癌队列进行了全面分析：DFCI（来自丹娜-法伯癌症研究所的原发性 CRC）、TCGA Pancancer（来自癌症基因组图谱联盟的原发性 CRC）和 MSKCC（来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心的原发性 CRC 和转移性 CRC）（参见“方法”）。这三个队列的患者在人口统计学、临床和病理学特征方面存在显著差异，我们在后续分析中考虑了这些差异（表1）。

表1. 本研究中使用的CRC数据集的临床和病理特征

RAS突变与肿瘤分期、MSI状态和队列的关联

在原发性结直肠癌（CRC）中， KRAS基因突变率为38%（670/1748），而NRAS和HRAS基因突变率则显著较低（分别为4.9%，85/1748和0.9%，15/1748）。转移灶中的突变频率与原发性肿瘤相似，KRAS（41%，216/532）、NRAS（3.9%，21/532）和HRAS（0.4%，2/532），与原发性肿瘤相比无统计学差异（图1）。原发性肿瘤和转移灶之间相似的突变率与RAS基因突变是CRC早期事件的普遍观点相符，更重要的是，这些基因的突变对转移进展没有显著影响。相比之下，CRC 中其他经常发生突变的基因，如抑癌基因APC、TP53、FBXW7和SMAD4，以及癌基因PIK3CA和BRAF，在比较原发肿瘤与转移瘤时，突变频率表现出统计学上的显著差异（图1）。

图1. RAS基因和其他常见突变基因在CRC中的突变频率。A. 原发性结直肠癌（I-II期、III期或IV期）和结直肠癌转移灶（M）中最常见的癌症相关基因突变频率。根据微卫星不稳定性（MSI）状态和肿瘤突变负荷（见“方法”），病例分为微卫星稳定型（MSS）（左）或微卫星不稳定性/高突变型（右）。B .采用多变量logistic回归分析Ras基因突变频率的差异。点表示对数比值比（x轴）。水平线表示对数比值比的95%置信区间，颜色代表经Tukey HSD法校正后的统计学显著性（显著性水平）。垂直虚线左侧的值表示相应比较中第一个列出的组的突变频率较高（y轴），而右侧的值表示第二个列出的组的突变频率较高。图中显示了两个多变量逻辑回归分析：一个包括所有样本，并以样本类型（原发肿瘤或转移）作为协变量（上排）；另一个仅包括原发肿瘤，以便将队列作为协变量纳入分析（下排）。

在原发性肿瘤中，KRAS突变在MSS型肿瘤中的发生率高于MSI/高突变型肿瘤（40% vs. 31%，OR=0.7，CI=[0.5–0.9]，p=0.002，Fisher精确检验），而HRAS突变与MSI/高突变型肿瘤密切相关（3.8% vs. 0.2%，OR=18.7，95%CI=[5–104]，p=2.7×10⁻⁷，Fisher精确检验）（图1）。KRAS突变在晚期肿瘤（III/IV期，399/955，41.8%）中的发生率高于I/II期肿瘤（253/743，34.1%，p=0.001，Fisher精确检验）。NRAS和HRAS在I/II期和III/IV期原发肿瘤中表现出相似的突变频率。包含生物性别、MSI状态、肿瘤分期和队列的多变量逻辑回归分析证实了KRAS突变与MSS肿瘤的关联（OR=1.4，CI=[1.1–1.8]，p=0.014），以及HRAS与MSI肿瘤的关联（OR=15.7，CI=[5.0–48.8]，p=2×10⁻⁶）（图1B）。值得注意的是，大多数HRAS突变（88%，17个突变中的15个）位于G12、G13、Q61、K117和A146以外的密码子，提示其致癌潜力尚不明确，可能仅作为乘客突变发挥作用。多变量逻辑回归分析显示，与DFCI队列相比，TCGA队列（OR=1.8，CI=[1.4–2.5]，p=4×10⁻⁶）和MSKCC队列（OR=2.2，CI=[1.6–3.0]，p=1.6×10⁻⁸）中KRAS突变更为常见。这种差异并非由不同队列间的生物性别、微卫星不稳定性（MSI）或分期差异所致（图1B）。对最常见突变基因进行类似的多变量分析显示，APC、TP53、PIK3CA和BRAF的突变频率在不同队列间存在显著差异。

同一患者肿瘤样本中KRAS突变的一致性

MSKCC数据集包含31例分析了多个肿瘤样本的病例。其中19例至少分析了一个原发肿瘤和一个转移灶，结果显示原发灶和转移灶的KRAS突变状态高度一致（17/19，89%）。这一观察结果与KRAS突变的克隆起源相符，并与之前的报道一致。仅有两例（P-0002463和P-0012418）的原发肿瘤和相关转移灶的突变状态存在差异。患者P-0002463的原发肿瘤为KRAS野生型，而转移灶携带G12A突变。在针对该染色体位置的二代测序读段中，仅有8.8%（1570个读段中的 138 个）检测到该突变，提示该突变是克隆扩增后获得的继发事件。相反，在P-0012418中，KRAS G13C突变存在于原发肿瘤中，但在转移灶中未检测到。该突变仅存在于3.5%的读段（811个读段中的29个）中，提示KRAS突变并非原发肿瘤中的克隆性突变，而产生转移灶的细胞为KRAS野生型，或者突变等位基因在肿瘤进展过程中丢失。

CRC中KRAS的突变谱

最常见的KRAS突变（即G12、G13、Q61、K117和A146密码子的突变）集中在GTP/GDP结合口袋周围（图2）。残基G12和G13位于P环内，紧邻GDP/GTP的二磷酸/三磷酸部分，它们参与活性位点GTP核苷酸的稳定。Q61位于开关II结构域的N端，该结构域在KRAS的ON和OFF状态转换过程中的构象变化中起着关键作用。K117与G13非常接近（<3Å），并与GDP/GTP的鸟嘌呤和核糖部分相互作用。最后，A146 位于GTP/GDP核苷酸鸟嘌呤部分附近的密集疏水区域，有助于核苷酸结合的特异性。

图2. GDP结合的野生型KRAS的结构。A. KRAS蛋白的表面结构图，突出显示了常见突变残基。残基Q61（红色）、G12和G13（橙色）、K117（黄色）和A146（蓝色）均已标注并以颜色区分。结合的GDP分子以球棍模型表示。B .野生型KRAS中GDP结合位点的放大图。GDP分子被细分为二磷酸、核糖和鸟嘌呤部分。原子以颜色区分（碳为灰色，氧为红色，氮为蓝色，磷为橙色）。KRAS残基（G12、G13、K117和A146）与GDP之间的关键相互作用以虚线表示：氢键（蓝色）、离子相互作用（黄色）和弱氢键（灰色）。G12的氧原子与K117的氮原子之间形成氢键，距离为2.94 Å。

我们对1748例原发性结直肠癌（CRC）肿瘤和532例转移灶中的KRAS突变谱进行了更详细的分析。综合所有样本来看，微卫星不稳定性（MSI）/高突变型CRC中KRAS G12突变的发生率低于微卫星稳定型（MSS）CRC（11% vs. 27%，OR=0.33，CI=[0.2–0.5]，Q值=2.6×10⁻¹⁰）（图3）。相反，G13、Q61、K117和A146密码子的突变在MSS和MSI/高突变型CRC之间未显示出统计学上的显著差异。正如预期，鉴于其显著的突变表型，MSI/高突变型肿瘤表现出更高的KRAS多突变发生率（OR=5.3，CI=[1.8–15.5]，Q值=0.003）和其他密码子突变发生率（OR=4.2，CI=[1.7–10.4]，Q值=0.003）（图3）。分析显示，与TCGA和MSKCC数据集相比，DCFI数据集中KRAS突变发生率较低主要反映了KRAS G12突变发生率较低，无论是在MSS病例（19% vs. 29%–31%）还是在MSI/高突变病例（2% vs. 15%–18%）中均是如此。在多变量逻辑回归分析中，这种差异仍然具有统计学意义，包括患者年龄、生物性别、肿瘤分期和 MSI 状态作为可能的混杂因素（DFCI与TCGA 队列相比，OR=0.5，CI=[0.3–0.7]，p=2.2×10 -6； DFCI与MSKCC队列相比，OR=0.4，CI=[0.3–0.6]，p=4×10 -6）。

图3. CRC中KRAS密码子特异性突变频率。A. 所有样本（ALL）和各队列中KRAS野生型（WT）和KRAS突变型的密码子频率。每个组显示两个百分比：括号外为相对于队列中所有样本的百分比；括号内为相对于KRAS突变型样本的百分比。B .使用Fisher精确检验分析MSS和MSI/高突变样本之间密码子特异性KRAS突变频率的差异。为了绘制与极端比值比相关的图，计算了Yule's Q值（见“方法”）。虚线垂直线（Yule's Q=0）右侧的点 表示MSI/高突变（MSI）肿瘤中频率较高，而左侧的点表示MSS肿瘤中频率较高。水平线代表Yule's Q值的95%置信区间，颜色代表使用FDR方法校正多重假设检验后的统计学显著性水平（显著性水平）。

与既往文献一致，12号和13号密码子的突变合计占CRC中所有KRAS突变的近82%，其发生率顺序为G12D>G12V>G13D>G12C>G12A>G12S（图4）。KRAS G12D和G13D在MSS和MSI/高突变病例中的发生率相似（G12D ： 10.8% vs. 7.8%，OR=1.4，p=0.1；G13D：7.2% vs. 7.5%，OR=0.96，p=0.8，Fisher精确检验）。相比之下，KRAS G12V突变在MSS癌症中是第二常见的突变，但在MSI/高突变型癌症中则少见得多（8.3% vs. 1.8%，p=2.3×10⁻⁶）。KRAS G12C突变在MSS病例中是第四常见的突变（3.1%），但在336例MSI/高突变型病例中均未发现（p=7.6×10⁻⁵）（图4）。值得注意的是，尽管KRAS G12D突变在同一研究（MSKCC）的MSI/高突变型原发肿瘤中占13%（13/97），但在19例MSI/高突变型转移灶中均未发现该突变。然而，这种差异未达到统计学意义（p=0.12）。

图4. MSS和MSI/高突变CRC中的KRAS突变。A. 所有样本（ALL，n=2280）以及不同研究中MSS（上排，n=1945）和MSI/高突变肿瘤（下排，n=335）的KRAS突变情况。突变按其在整个数据集（包括KRAS 野生型（WT）病例）中的发生率排序。每个组显示两个百分比：括号外为相对于队列中所有样本的百分比；括号内为相对于KRAS突变体的百分比。B .使用Fisher精确检验分析MSS和MSI/高突变样本之间密码子特异性KRAS突变频率的差异。为了便于绘制具有极端比值比的关联图，计算了Yule's Q值（参见“方法”）。虚线垂直线（Yule's Q=0）右侧的点 表示在微卫星不稳定性/高突变（MSI）肿瘤中频率较高，而左侧的点表示在微卫星稳定（MSS）肿瘤中频率较高。水平条形图代表 Yule's Q值的 95% 置信区间，颜色代表使用 FDR 方法校正多重假设检验后的统计显著性水平（显著性水平）。

在密码子61（占所有KRAS突变的4.5%：Q61H>Q61K>Q61R>Q61L）、A146（占所有KRAS突变的7.4%，A146T>A146V>A146P）和K117（K117N>K117R）处发现了较低发生率的突变。除KRAS Q61K外，这些突变在MSS和MSI/高突变型CRC之间未显示出统计学上的显著差异。KRAS Q61K在MSI/高突变型CRC中的发生率（2.1%）高于MSS型CRC（0.31%，OR=6.9，p=0.001）。

我们发现不同研究中KRAS突变频率存在一些差异。对原发肿瘤进行多变量logistic回归分析，并将患者年龄、性别、肿瘤分期和MSI状态作为可能的混杂因素纳入考量，结果显示不同研究中G12D和G12V突变的发生率存在统计学意义上的显著差异，这主要反映了DFCI数据集中这些突变的发生率较低。

共突变分析

由于KRAS、NRAS、HRAS和BRAF基因的致癌突变具有重叠的下游效应，因此通常认为这些突变是互斥的。因此，同一信号通路中多个基因的致癌突变并不一定能为癌细胞提供显著的额外生长优势。非典型BRAF突变（非V600E突变，例如激酶活性降低的2类变异体和激酶活性受损或缺失的3类变异体）常与其他RAS通路突变同时发生。然而，KRAS突变也可能与其他癌症基因的突变同时发生，这可能会限制KRAS靶向治疗的疗效，或者反过来，这种联合治疗策略可以用于改善患者的预后。

我们分析了KRAS、NRAS和HRAS与IMPACT-341测序panel中包含的其余341个癌症相关基因的共突变情况。IMPACT-341测序panel代表了所有样本中分析的最小基因集。为了控制MSI/高突变表型对总体突变频率（从而对共突变概率）的混杂影响，我们分别对MSS和MSI/高突变原发肿瘤进行了分析。

在MSS型原发性CRC中，KRAS突变与APC、PIK3CA、FBXW7、AMER1和SMAD2基因突变频率显著升高相关，而与BRAF、NRAS和TP53基因突变频率降低相关。NRAS基因突变与APC基因突变频率升高相关，而与KRAS基因突变频率降低相关。在MSI/高突变型CRC中，KRAS突变与APC基因突变频率升高相关，而与BRAF基因突变频率降低相关（图5）。

图5. 原发性CRC中KRAS、NRAS和HRAS共突变分析。采用Fisher精确检验计算MSS（上排）和MSI/高突变（下排）原发性CRC中的共突变分析。为了便于绘制具有极端比值比的关联图，计算了Yule's Q值（y轴）。水平虚线（Yule's Q=0）上方的点表示正相关（共突变），而虚线下方的点表示负相关（互斥性）。垂直线表示Yule's Q值的95%置信区间。颜色表示使用FDR方法校正多重假设检验后的统计学显著性水平。FDR校正后的p值低于0.05的基因已标记。条件共突变频率（x轴）表示KRAS、NRAS或HRAS突变型CRC中同时存在所研究基因突变的比例。 B图A详细展示了共突变分析发现的具有统计学意义的关联。图中显示了比值比和95%置信区间（OR [CI95%]）以及FDR校正后的p值。此外，图中还标明了A突变型病例和A野生型病例中B基因突变病例的比例。

我们在1.2%（22/1748）的原发性结直肠癌和1.5%（8/532）的转移性结直肠癌中发现了KRAS和BRAF同时突变。这些病例中大多数携带非典型BRAF突变（非V600E，n=23，77%），6例（40%）携带非典型KRAS突变（位于G12、G13、Q61、K117或A146以外的密码子）。在微卫星稳定型（MSS）肿瘤中，未观察到KRAS和BRAF V600E同时突变。仅有4例肿瘤（均为微卫星不稳定性/高突变型）显示BRAF V600E与已知的致癌性KRAS突变（2例G12D、1例G12A和1例G13D）共存；值得注意的是，这两个KRAS G12D病例除了V600E突变外，还携带非典型的BRAF突变，这可能会影响BRAF的功能。

KRAS密码子特异性共突变分析

我们研究了携带不同KRAS突变的肿瘤在其他癌症相关基因中是否表现出不同的突变谱。具体而言，我们评估了最常见KRAS突变密码子（G12、G13、Q61、K117和A146）的突变是否与IMPACT-341 panel中包含的340个基因的突变频率差异相关。在携带KRAS突变的微卫星稳定型（MSS）原发肿瘤中，我们未观察到与KRAS突变密码子相关的其他基因突变率存在统计学意义上的显著差异。相反，在微卫星不稳定性（MSI）/高突变型原发肿瘤中，我们发现了11个基因，它们的突变频率因KRAS突变密码子的不同而存在差异（图6）。值得注意的是，其中五个基因——DDR2、KDR（VEGFR2）、EPHA3、ALK和FLT1（VEGFR1） ——编码跨膜受体蛋白酪氨酸激酶，在 MAPK 通路上游的细胞信号传导中发挥作用（富集倍数=5.37，p=9×10⁻⁴，FDR Q值=0.04）。

图6. 与MSI/高突变原发性CRC中密码子特异性KRAS突变相关的突变基因。名义p值通过对列联表进行 Fisher 精确检验计算得出，列联表仅包含KRAS基因G12、G13、A146、Q61或K117位密码子发生突变的病例。野生型病例在图中作为参考，但未用于Fisher精确检验。基因按其名义p值排序。

KRAS和Ras-GAP编码基因的共突变

KRAS G13突变体在体外对NF1介导的GTP水解表现出部分敏感性。据报道，携带KRAS G13或A146突变的癌细胞系与携带G12突变的癌细胞系相比，NF1共突变频率更高。相反，携带Q61突变的癌细胞系未显示NF1共突变。在一项包含大量不同来源肿瘤样本的研究中，约12%的KRAS G13突变样本携带NF1突变，而仅有5.5%的KRAS G12突变样本携带NF1突变。

在本研究中，无论是在原发肿瘤（23.4% vs. 2.1%；OR=12.5，95% CI：8–20；p<2×10⁻¹⁶）还是转移灶 （37% vs. 2.3%；OR=24，95% CI：6.7–81；p=8.6×10⁻⁷）中，NF1突变在MSI/高突变型肿瘤中的发生率均显著高于MSS型肿瘤。NF1基因非常大，跨越287 kb，编码序列长度接近8.5 kb（第99百分位数），因此容易发生突变，尤其是在具有突变表型的肿瘤中。然而，在MSS或MSI/高突变CRC中，NF1突变的频率并不高于其他长度相当的基因，这表明CRC中不存在对NF1失活的强阳性选择。

在所有研究的CRC队列中，我们均未发现KRAS G13突变与NF1突变之间存在统计学意义上的关联（图7）。在MSS肿瘤中，KRAS G12（0.8%）和G13（0.9%）突变体中NF1突变的发生频率均较低，均低于KRAS野生型病例（3%）。在MSI/高突变型CRC中，KRAS G13突变体中NF1突变的发生频率（13%）低于G12突变体（21%）和野生型病例（23%），但这些差异无统计学意义。在包含队列、性别、年龄、MSI/高突变状态和KRAS密码子的多变量logistic回归模型中，仅MSI/高突变状态与NF1突变显著相关（p<2×10⁻¹⁶）。

图7. NF1和RASA1与密码子特异性KRAS突变的共突变分析。根据突变的KRAS密码子对MSS（A）和MSI/高突变（B ）肿瘤中的NF1（左）和RASA1 （右）突变频率进行分类。名义p值通过Fisher精确检验计算得出，检验对象为包含KRAS密码子G12、G13、A146、Q61或K117突变病例的列联表。野生型病例作为参考，但未用于Fisher精确检验。未发现NF1或RASA1突变与突变的KRAS密码子之间存在统计学意义上的关联。

我们将KRAS共突变分析扩展至RASA1，RASA1编码另一种重要的GTP酶激活蛋白，该蛋白在人类癌症中经常发生突变。RASA1突变的结果与NF1的观察结果相似。具体而言，与大小相近的基因相比，我们未发现MSS或MSI/高突变型CRC中RASA1突变频率增加的证据，也未发现RASA1突变与KRAS突变状态之间存在关联（图7）。这些观察结果在MSK-CHORD数据集上得到了进一步验证，该数据集包含超过5000个CRC样本。

KRAS靶向化合物

通过对NCI词库和PubChem数据库进行系统检索，结合自动检索和人工筛选（见“方法”部分），共检索到106种靶向SHP2/SOS1/KRAS的药物或细胞疗法。该列表包含73种抑制剂、15种T细胞受体（TCR）、14种疫苗、3种降解剂和1种反义寡核苷酸。这些化合物中大多数直接靶向KRAS（n=89），其余则靶向SOS1（n=5）或SHP2（n=12）。其中大多数靶向特定的KRAS突变（32种靶向KRAS G12C，22种靶向KRAS G12D，6种靶向KRAS G12V，1种靶向KRAS G13N）。其中19种化合物靶向多种KRAS突变亚型，26种化合物靶向任何类型的KRAS突变，原因在于这些化合物要么抑制所有KRAS亚型（包括野生型），要么靶向SOS1或SHP2，从而抑制GDP到GTP的交换，进而抑制KRAS从非活性形式向活性形式的转变。这85种化合物已在或正在进行针对CRC患者的临床试验（图8）。

图8. 靶向KRAS、SOS1或SHP2的药物。本研究鉴定的106种化合物示意图。每条线代表一种化合物，连接化合物类型（左列）、靶点（中列）以及是否已进入CRC患者临床试验（右列）。线条颜色根据化合物的靶点而定。

针对KRAS靶向疗法的结直肠癌临床试验正在进行中

我们对临床试验数据库进行了系统性检索，结合自动搜索和人工筛选，共检索到156项临床试验，这些试验已评估或正在评估至少一种化合物对结直肠癌（CRC）患者的疗效（参见“方法”部分）。图9展示了这些试验的时间轴，图中标明了所测试的化合物、靶点、试验阶段以及当前状态。此外，我们还提供了包含这156项临床试验完整信息的表格作为补充材料。该表格包含临床试验数据库提供的数据、所研究的化合物或治疗方法（类型、靶点）的数据，以及PubMed和PubMed Central数据库中引用这些临床试验的参考文献。

图9. 针对CRC患者的KRAS靶向治疗的临床试验。图8展示了包含至少一种化合物的临床试验的时间轴图，这些化合物均来自实体恶性肿瘤（包括结直肠癌）患者，并评估了其疗效。水平线段代表临床试验的计划开始日期和结束日期。每条柱状图的左侧标明了靶向KRAS突变或KRAS相关蛋白，右侧标明了KRAS相关药物。临床试验按研究阶段分为不同的面板，并根据研究状态着色。白色圆点表示最新信息更新。灰色竖条表示当前日期。

在156项临床试验中，有52项评估了专门靶向KRAS G12C的化合物（图9），尽管这种突变在结直肠癌（CRC）中的发生率极低。这主要是由于G12C抑制剂的早期研发和监管审批，这些抑制剂开创了人们对KRAS作为药物靶点的兴趣。这些药物在临床前CRC模型中显示出活性，并在非小细胞肺癌（NSCLC）中显示出临床疗效，促使人们评估它们在其他KRAS G12C突变肿瘤（包括CRC）中的疗效。

然而，治疗格局正迅速发展，不再局限于G12C特异性策略。越来越多的近期和正在进行的临床试验正在研究针对CRC中常见的其他KRAS突变（例如G12D和G12V）的抑制剂，以及旨在抑制所有KRAS突变的更广泛方法（图10）。一些临床试验也在评估联合疗法，例如将KRAS抑制剂与EGFR、SHP2或免疫检查点阻断剂联合使用，以克服耐药性并提高缓解率。

图10. Ras/MAPK和PI3K/AKT/mTOR信号通路。配体结合后（图中以细胞膜外的黄色球体表示），受体酪氨酸激酶（RTK）募集衔接蛋白（SHP2、GRB2和SOS），促进KRAS上的GDP与GTP交换，从而激活KRAS（KRAS-GTP）。激活的KRAS通过RAF、MEK和ERK等下游信号通路促进细胞生长、增殖、存活、运动和迁移。RTK和G蛋白偶联受体（GPCR）均可通过Gβγ亚基激活PI3K，催化PIP2转化为PIP3。PIP3促进AKT的膜募集，并通过PDK1和mTORC2激活AKT。激活的AKT调节下游效应分子，包括TSC1/2复合物和mTORC1，从而控制细胞生长和存活。RAS-GAPs（例如NF1）和PTEN（一种脂质磷酸酶，可将PIP3还原为PIP2）介导负调控。本研究中讨论的化合物靶点以橙色方框标出。截至2025年6月1日，仅有靶向RAS(OFF) G12C的sotorasib和adagrasib获得FDA批准用于治疗CRC。其他靶向RAS上游的治疗药物（例如西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、呋喹替尼、瑞戈非尼、图卡替尼和ziv-aflibercept）也已获得FDA批准用于治疗CRC，但本文未对此进行讨论。

目前有80项试验正在招募患者，另有11项试验将在不久的将来招募患者，这反映出临床上积极希望扩大治疗KRAS突变型CRC患者的治疗选择，而不仅仅局限于KRAS G12C突变病例。

讨论

尽管KRAS是最早被发现的原癌基因之一，也是人类癌症中最常见的突变癌基因，但在近40年的时间里，它一直被认为是无法成药的。近年来，随着针对KRAS G12C（一种在结直肠癌(CRC)中相对罕见的突变）的选择性共价抑制剂的开发，这种观点发生了改变（图4）。最近，针对更常见KRAS突变的新型药物以及抑制多种或所有KRAS亚型的泛KRAS药物正在进行测试，这有望扩大KRAS靶向治疗的受益人群。为了确定这些新一代KRAS靶向疗法对CRC患者的影响，必须了解KRAS突变和共突变的谱系，并考虑到该疾病的遗传异质性。

我们利用三个最大的公开可用的结直肠癌数据集（包含临床和突变信息）对KRAS突变频率进行了全面分析。值得注意的是，尽管这些研究中的患者并非根据其KRAS突变状态进行选择，但这些数据集并非严格意义上的人群数据集。尤其值得注意的是，MSKCC研究纳入了较高比例的IV期结直肠癌患者（约60%，表1），因为其主要目的是比较转移性结直肠癌和非转移性结直肠癌。MSI/高突变原发肿瘤的频率为18.1%（95% CI，16.3%–20%），与结直肠癌患者人群中报道的频率（15%–20%）一致，且三个队列之间未观察到统计学意义上的显著差异（卡方检验，p=0.24）。正如预期的那样，MSKCC转移样本中MSI/高突变肿瘤的比例显著较低（3.6%，表1），这反映了MSI CRC的转移潜能较低。为了减少潜在的偏倚，在统计分析中将肿瘤分期和MSI/高突变状态作为协变量纳入，或者分别对MSS和MSI/高突变肿瘤进行分析。

我们详细概述了MSS型和MSI/高突变型CRC中特定KRAS突变和共突变的发生率，并发现所研究数据集之间存在显著差异，这些差异无法用人口统计学特征（年龄、性别）或肿瘤分期差异来解释。先前已有研究描述了不同人群中mCRC患者KRAS突变患病率的差异。也有研究报道，与白种人CRC患者相比，非裔美国人CRC患者的KRAS突变发生率更高（OR=1.56，95%CI=[1.30-1.87]，p=0.0001）。然而，我们研究中使用的数据集并未包含患者遗传祖先的完整信息；因此，我们无法确定不同数据集之间KRAS突变的差异是否与遗传祖先组成的变化有关。

大多数KRAS 12号密码子突变体在内在GTP水解和GAP介导的GTP水解方面均表现出显著的损伤，但核苷酸交换速率并未改变。KRAS G12C突变体是一个例外，在稳态下，约75%的突变蛋白与GTP结合，但其内在GTP酶活性仍与野生型KRAS相似，且远高于其他G12位点的致癌突变体。RAS蛋白的突变也会影响其与下游效应分子的结合亲和力。例如，与野生型KRAS相比，KRAS G12D突变体与RAF1-RBD（Ras结合域）的亲和力大约降低了五倍。

既往研究表明，与13号密码子突变相比，12号密码子KRAS突变通过抑制细胞凋亡和增强非接触依赖性生长，展现出更高的致癌潜能。体外和体内实验均证实，12号密码子突变的转化能力高于13号密码子突变。一项针对晚期或复发性结直肠癌的回顾性研究发现，12号密码子突变患者的总生存期低于KRAS野生型患者，而13号密码子突变对生存期无显著影响。对晚期和复发性结直肠癌患者的进一步研究发现，在五种最常见的12号密码子突变中，G12D和G12V与诊断后较差的总生存期独立相关。然而，最近的研究并未观察到KRAS G12D与其他KRAS突变体之间存在预后差异。综上所述，这些发现表明KRAS G12D的预后意义仍然不确定，并且可能取决于具体情况，会因患者人群、肿瘤分期和伴随的分子改变而变化。

我们的分析揭示了DFCI队列中KRAS G12突变频率的显著差异，这种差异无法用人口统计学（生理性别或年龄）或病理学（肿瘤分期和MSI状态）差异来解释，与其他两个研究队列（图1和图3）相比，这种差异是无法解释的。

尽管KRAS突变通常被认为与MSS肿瘤相关，但我们的分析表明，这种情况尤其适用于G12突变，因为我们发现MSS与MSI/高突变肿瘤之间其他密码子（G13、Q61、K117和A146）的突变频率没有显著差异（图3）。此外，更详细的分析显示，在两个数据集（TCGA和MSKCC）中，最常见的KRAS突变G12D在MSS和MSI/高突变原发性CRC中的发生率相似（图4）。相比之下，G12V突变的发生率要低得多，而G12C突变尽管具有突变表型，但在MSI/高突变癌症中却从未发现，这表明这两种突变的致癌潜力可能受到细胞遗传背景的影响。

KRAS基因13号密码子的突变表现出独特的特征。具体而言，13号密码子突变体影响水解作用，并显著增加内在核苷酸交换约10倍。值得注意的是，有报道称抑癌基因NF1在KRAS G13突变细胞中常发生共突变，但在KRAS 12号或61号密码子突变的癌症中很少发生突变。有趣的是，NF1 GAP蛋白对KRAS G12和Q61突变的KRAS无活性；然而，当其与KRAS G13D结合时，会刺激GTP水解。结果表明，KRAS G13D突变细胞也能以NF1依赖的方式对EGFR抑制剂产生反应。KRAS G13D CRC可能对EGFR抑制产生反应的临床观察结果，可以用其对NF1刺激的GTP水解敏感性增加来解释。在NF1活性正常的情况下，KRAS G13D癌细胞的KRAS GTP水平可能降低，并部分依赖于EGFR或其他受体酪氨酸激酶的上游信号传导。我们的分析未观察到NF1或RASA1突变与任何特定KRAS密码子显著富集，这表明NF1失活并非CRC中KRAS驱动的肿瘤发生的常见机制。此外，NF1和RASA1的突变频率在MSS和MSI/高突变肿瘤中均与其他长度相近的基因相似，表明这些基因的突变并非肿瘤发生或进展的强选择压力。MSI/高突变肿瘤中较高的NF1突变频率可能反映的是潜在的高突变表型，而非功能选择。

谷氨酰胺-61 (Q61) 位于KRAS GTP水解结构域的开关II区（图2）。该残基的突变会损害KRAS的固有GTP水解和GAP介导的GTP水解。这些突变还会加速GDP-GTP交换速率，导致突变蛋白在GTP结合状态下积累。特别是，与野生型KRAS相比，Q61H和Q61L突变会导致固有水解速率显著降低，约40至80倍。此外，与野生型KRAS相比，这些突变还会导致GAP刺激的水解速率显著降低。然而，Q61L突变体的GAP刺激速率比其固有速率高约15倍，这表明Q61L突变体中部分GAP依赖性催化机制仍然具有功能。与这些观察结果一致，与G12和A146突变体类似，携带Q61突变的CRC肿瘤对EGFR抗药治疗表现出耐药性，表明这些突变会损害体内GAP刺激水解的反应。

KRAS基因117位密码子的突变虽然不如12、13或61位密码子的突变常见，但却代表了一类独特的激活性改变。K117N突变通过增强核苷酸交换和降低GTP水解促进KRAS的组成型激活，但其程度低于G12或Q61突变体。生化分析显示，K117突变导致GAP刺激的GTP水解中度受损，并增强了与RAF等效应分子的结合，这支持了其致癌潜力。功能上，它们赋予KRAS基因不依赖于生长因子的信号传导，但其转化活性通常低于经典的G12突变。临床上，K117突变对EGFR抑制剂治疗的预测价值尚不明确。一些回顾性分析已将K117纳入与EGFR阻断耐药相关的非经典RAS突变中，但由于该突变发生率较低，证据有限。K117突变的相对低频率和中间生化表型凸显了进一步机制研究和临床分层的必要性。

KRAS基因A146密码子的突变表现出独特的特征。Poulin等人的研究表明，KRAS A146T突变体外固有GTP水解活性与KRAS G12D相似，但显著低于KRAS野生型。然而，KRAS G12D的GAP介导的GTP水解活性显著降低，而KRAS A146T的GAP介导的GTP水解活性仅轻微降低。此外，KRAS A146突变导致GEF介导的核苷酸交换增加，但不影响GAP活性。关于抗EGFR治疗对携带KRAS A146突变的CRC患者的影响，目前尚无定论。一些研究表明，与携带其他KRAS突变的肿瘤患者相比，携带KRAS A146突变肿瘤的CRC患者在接受抗EGFR治疗后，临床预后更佳。相反，其他研究表明，具有KRAS A146突变的肿瘤与抗EGFR疗法的耐药性有关。

截至2025年6月，仅有阿达格拉西布（adagrasib）和索托拉西布（sotorasib）获得FDA批准用于治疗结直肠癌（CRC）患者。阿达格拉西布（Krazati）于2024年6月21日获得FDA批准，用于治疗KRAS G12C突变的局部晚期或转移性结直肠癌。该批准用于与西妥昔单抗（Erbitux）联合治疗既往接受过氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康类化疗的患者。索托拉西布（Lumakras）与帕尼单抗（Vectibix）联合治疗于2025年1月16日获得FDA批准，用于治疗结直肠癌。该批准专门用于治疗既往接受过氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康类化疗的KRAS G12C突变转移性结直肠癌成人患者。欧洲药品管理局 (EMA) 尚未批准 sotorasib 或 adagrasib 用于结直肠癌 (CRC) 的治疗，但这些药物可能通过临床试验或同情用药途径获得。尽管已获批准，但这两种抑制剂仅靶向罕见的KRAS G12C突变，该突变约占微卫星稳定型 (MSS) CRC病例的3%，且在微卫星不稳定性 (MSI)/高突变型病例中未发现（图4），因此限制了其对绝大多数CRC患者的适用性。

在156项临床试验中，有52项评估了专门靶向KRAS G12C的化合物（图9），尽管这种突变在结直肠癌（CRC）中的发生率极低。这主要是由于G12C抑制剂的早期研发和监管审批，这些抑制剂开创了KRAS作为药物靶点的研究先河。这些药物在临床前CRC模型中显示出活性，并在非小细胞肺癌（NSCLC）中显示出临床疗效，促使人们评估它们在其他KRAS G12C突变肿瘤（包括CRC）中的疗效。

尽管目前G12C抑制剂存在局限性，但KRAS突变型结直肠癌的治疗格局正在迅速发展。大量临床试验正在进行中（图9），旨在研究针对其他更常见的KRAS突变（如G12D、G12V和G13D）的新型药物。这些努力反映了药物研发的重大转变，不再局限于G12C，而是着眼于更广泛的KRAS改变，这些改变构成了大多数KRAS突变型结直肠癌病例。特别是，泛RAS抑制剂和RAS(ON)抑制剂的出现是一项重大突破。这些药物旨在抑制多种KRAS突变亚型或靶向处于活性GTP结合状态的KRAS，从而克服了早期化合物的突变特异性局限性。其中一些新型抑制剂已进入I期和II期临床试验（图9），早期结果表明，它们可能为更大比例的结直肠癌患者带来显著的临床获益。

目前，多项临床试验正在评估联合疗法，例如将KRAS抑制剂与EGFR、SHP2或免疫检查点阻断剂联合使用，以克服耐药性并提高缓解率。此外，针对突变型KRAS的免疫治疗策略也正在蓬勃发展。肽疫苗、mRNA疫苗和T细胞受体（TCR）工程化疗法等方法正在临床环境中积极研究。这些疗法旨在利用免疫系统特异性识别并清除KRAS突变型肿瘤细胞，为实现持久缓解带来新的希望。

综上所述，这些正在进行的努力可能标志着KRAS突变型结直肠癌治疗的新纪元。目前临床试验的多样性和规模体现了人们克服KRAS靶向治疗历史挑战的坚定决心和浓厚兴趣。随着这些新疗法在临床开发中不断推进，人们越来越乐观地认为，不久的将来，将有更多有效且涵盖所有突变类型的治疗方案惠及更广泛的结直肠癌患者群体。

本研究全面且最新地概述了结直肠癌中KRAS突变及其治疗策略，整合了大型公开数据集以及来自多个数据库和临床试验注册中心的精选信息。本研究的一大优势在于系统地交叉引用化合物、临床试验和突变频率，并对MSS和MSI病例进行细致分层，从而提高了准确性和临床相关性。此外，本研究还重点关注具有临床意义的共突变模式，并为正在进行的治疗研究提供了背景信息，使其既可作为该领域的资源，也可作为参考。总而言之，我们的整合分析强调了KRAS突变密码子特异性和上下文特异性表征对于指导结直肠癌精准肿瘤学的重要性。然而，我们也承认本研究存在一些局限性。首先，本研究依赖于公开数据集，尽管这些数据集规模庞大且适用于此类分析，但它们并非基于人群，因此可能存在选择偏倚；突变频率可能无法完全反映在未经选择的、源自人群的队列中观察到的情况。其次，数据库注释可能不完整或不一致，尽管进行了广泛的交叉引用，但由于索引方式或报告标准不统一，一些化合物或试验可能仍被遗漏。最后，KRAS靶向疗法是一个快速发展的领域，未来很可能会出现更多未纳入本研究的化合物和临床试验。

总之，我们的研究证实了既有认知，并对CRC中KRAS突变的发生机制提出了新的见解。KRAS突变在CRC中高度普遍，最常累及12和13号密码子，较少累及61、117和146号密码子。原发灶和转移灶之间KRAS突变的高度一致性反映了其早期克隆起源。我们的分析表明，突变分布因微卫星不稳定性（MSI）状态而异。MSS肿瘤常携带KRAS-PIK3CA共突变。在MSS原发性CRC中，KRAS突变常与PIK3CA突变同时发生。这种共突变模式可能具有临床意义，因为单独靶向KRAS可能不足以抑制肿瘤生长。与之前的报道相反，我们发现KRAS G13突变与NF1突变之间没有关联；相反，NF1改变与MSI/高突变肿瘤的发生率与其他大基因相似。目前，FDA批准的KRAS抑制剂仅靶向KRAS G12C，这是一种MSS CRC中的罕见变异，在MSI CRC中几乎不存在。然而，治疗领域正在迅速扩展，涵盖了更常见的KRAS等位基因（例如G12D、G12V、G13D）的抑制剂、泛RAS和RAS(ON)抑制剂，以及免疫疗法，例如疫苗和基于TCR的疗法。

方法

结直肠癌数据集

突变和临床数据主要来源于两个数据库：癌症体细胞突变目录（COSMIC）和cBioPortal提供的结直肠癌队列。我们访问了三个队列：DFCI（619例原发性结直肠癌）、TCGA泛癌（594例原发性结直肠癌样本）和MSKCC（601例原发性结直肠癌样本和533例转移性结直肠癌样本）。在本文撰写期间，MSK-CHORD研究发布了一个更大的数据集。该泛癌数据集包含来自MSKCC的5543例结直肠癌样本，其中一些与我们分析中使用的样本重叠。然而，该数据集的临床信息缺少患者确诊时的年龄（而是提供其当前年龄，这与之前发表的重叠数据集不同），并且分期信息不如我们分析中使用的数据集详细。这些局限性使得MSK-CHORD数据与其他数据集的整合变得困难。更重要的是，与DFCI和TCGA数据集相比，MSK-CHORD数据集的样本数量显著更多，这会给分析带来相当大的偏差。因此，我们决定不将MSK-CHORD数据集纳入本研究。尽管如此，我们仍使用该数据集来验证一些观察结果，例如共突变关联以及KRAS G13与NF1突变之间缺乏关联。

TCGA队列中有66例病例和MSKCC队列中有1例病例因缺乏突变信息而被排除在后续分析之外。数据中缺少两名患者的生物性别信息，即TCGA-M5-AAT5和TCGA-M5-AATA。这两名患者的生物性别（分别为女性和男性）是根据从GDC数据门户获取的X染色体甲基化谱推断的。14例TCGA病例和56例DFCI病例缺少肿瘤分期信息。在TCGA病例中，可以通过查阅GDC数据门户中获取的病理报告，根据TNM分期信息确定肿瘤分期。对于56例DFCI病例，由于病理报告未公开，因此无法确定肿瘤分期。合并数据集包含2287例结直肠癌（CRC）。根据注释的MSI状态，病例被分为MSS或MSI：DFCI（438例MSS，91例MSI-high，90例未确定）和MSKCC（701例MSS，105例MSI，328例未确定或不确定）。TCGA病例中，MSI MANTIS评分大于0.4的病例被归类为MSI。高突变肿瘤的鉴定基于其非同义肿瘤突变负荷（TMB）。DFCI和TCGA样本中TMB大于14个突变/Mb的被认为是高突变的，而对于MSKCC样本，则应用了25个突变/Mb的TMB阈值，如先前报道。不同的阈值是由于不同队列间TMB的差异造成的，而这种差异是由不同的测序策略引起的。TCGA和DFCI数据集采用全外显子组测序 (WES) 进行分析，而MSKCC样本则使用富集癌症相关基因的靶向测序panel进行测序（214个样本使用IMPACT-341，910个样本使用IMPACT-410，9个样本使用IMPACT-468）。所有分析中，病例均根据TCGA提出的分类标准分为MSS和MSI/高突变型。

共突变分析

突变数据来自cBioportal。本研究重点分析了所有样本中涉及的341个基因（包含在IMPACT-341测序panel中的基因）。对于每对基因（A和B），条件共突变频率 (CCMF) 计算为基因A发生突变且基因B也发生突变的样本百分比（CCMF=100×(NAB/NA)，其中NAB为基因A和B均发生突变的样本数，NA为基因A发生突变的样本数）。共突变的统计分析采用Fisher精确检验（基于列联表）进行单变量分析，或采用逻辑回归，并进行Tukey事后检验（Tukey's HSD）进行多变量分析。为了以图形方式呈现具有极端值（例如等于零或无穷大）的优势比 (OR)，我们采用了尤尔关联系数，它是优势比的归一化变换 (Q=(OR−1)/(OR+1))。Q值为+1表示完全共现，-1表示完全互斥，0表示无关联。与优势比不同，尤尔Q值能够压缩较大的效应量并避免奇异性，从而为突变频率差异很大的基因提供更易于解释且视觉上更稳定的比较。

KRAS 3D渲染

GDP结合的野生型KRAS的结构来自参考文献（ID：5W22），可在PDB数据库中获得，并使用Mol*进行渲染。

统计分析

统计分析使用R语言进行。正态性检验采用Shapiro-Wilk检验。正态分布变量采用参数检验（例如t检验、ANOVA）进行分析。非正态分布变量采用非参数检验（Wilcoxon-Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis检验）进行分析。单变量分析中，比例差异采用Fisher精确检验（基于列联表）进行分析；多变量分析中，比例差异采用逻辑回归进行分析。分类变量各水平之间的两两比较采用emmeans包中的pairs函数进行评估，该函数对边际均值进行两两t检验，并使用Tukey法校正多重比较。基因集富集分析采用PANTHER Overrepresentation Test进行。名义p值小于2×10⁻¹⁶的结果汇总为p值<2×10⁻¹⁶。必要时，采用错误发现率 (FDR) 方法进行多重假设检验校正。FDR校正后的p值（称为Q值）小于0.05被认为具有统计学意义。

KRAS靶向化合物、临床试验和文献综述汇编

我们从NCI词库数据库中检索到66种靶向Ras的化合物（47种抑制剂、11种疫苗、6种TCR和2种降解剂）、12种靶向SHP2的化合物和4种靶向SOS1的化合物。为了减少冗余，我们未考虑某些药物的盐形式（例如，己二酸迪伐拉西布、利戈塞替钠、甲苯磺酸索拉非尼、甲磺酸达拉非尼、马来酸利非拉非尼和无水瑞戈非尼）。值得注意的是，NCI词库数据库中将帕鲁拉肽和Ras抑制剂LUNA18列为两个不同的代码（分别为C206963和C185876），而它们实际上是同一种化合物（CID 166509683）。我们在临床试验数据库中发现了24种靶向KRAS、SOS1或SHP2的治疗化合物，这些化合物未被NCI词库数据库收录，我们手动将其添加到数据库中，使靶向KRAS/SOS1/SHP2的化合物数量增加到106种。我们将这些信息与临床试验进行比对，这些临床试验在“条件”字段中注明了结直肠癌、结肠癌、直肠癌、CRC或实体瘤，在“研究类型”中注明了“干预性”，在“主要目的”中注明了“治疗性”，最终检索到153项研究，其中至少有一种药物曾被测试或正在测试。我们注意到，有三项重要的研究，即NCT06385925、NCT04330664和NCT03785249，由于它们在“条件”字段中没有明确注明结直肠癌或实体瘤，因此未能通过此策略检索到。这些研究是手动添加到列表中的，最终共纳入156项临床试验。对于11项“完成日期”字段缺失信息的临床试验，我们使用了“最后更新日期”。我们在PubMed（检索所有字段）和PMC（检索标题、摘要或正文关键词）中检索了引用这些临床试验的科学文章。