2025年6月15日 美国癌症研究杂志

摘要

H3K27突变导致的弥漫性中线胶质瘤 (DMG) 是一种普遍致命的疾病，除姑息性放射治疗外，尚无其他治疗策略。将已上市的非肿瘤药物重新用于肿瘤治疗，正成为一种快速发展的新方法，以加速DMG急需的新治疗方案的开发。重新利用的驱虫药甲苯咪唑 (MBZ) 因其良好的抗癌特性、高神经渗透性、良好的药代动力学和安全性，在治疗脑肿瘤方面备受关注。尽管MBZ正在针对包括DMG在内的脑肿瘤进行I/II期临床试验，但MBZ的抗癌特性及其潜在作用机制在DMG临床前模型中尚不清楚。我们发现，在7株K27M突变或野生型H3的DMG细胞系中，有6株细胞活力显著降低。所有IC 50值均在临床可达到的范围内。 MBZ 的抗增殖特性通过将 DMG 细胞阻滞于 G 2/M 期，同时上调关键细胞周期调控因子 p21 和 p27 的表达来实现，而 p53 的上调和活化则与细胞环境相关。在相同的生长抑制浓度下，MBZ 可引发细胞凋亡，其证据是凋亡标志物 caspase-3 和 PARP 裂解水平的升高。Annexin V-碘化丙啶 (PI) 双染结果一致显示，在两个凋亡阶段，MBZ 的剂量依赖性增加。值得注意的是，MBZ 与同类首创的咪唑啉酮 ONC201 的组合协同增强了两种 DMG 细胞系中的抗增殖作用，这通过采用不同算法的组合评分进行评估，并在另外两种细胞系中显示出叠加效应。从机制上讲，该组合增强了MBZ或ONC201的促凋亡活性，同时不改变单药诱导的细胞动力学扰动。最后，一对ONC201敏感和ONC201抗性的获得性耐药DMG细胞系对MBZ表现出相同的反应性，IC 50和E max值也相似。总而言之，MBZ表现出较高的生长抑制/促凋亡活性、对ONC201的化学增敏作用以及在DMG细胞培养中克服ONC201耐药性的能力，有望成为一种新的低毒DMG治疗药物，并有可能用于二线治疗和/或联合方案。

介绍

弥漫性中线胶质瘤 (DMG) 是儿童癌症相关死亡的主要原因。根据世界卫生组织 (WHO) 最新的中枢神经系统 (CNS) 肿瘤分类，这类肿瘤被归类为 DMG H3 K27 变异型，这是因为组蛋白 H3 赖氨酸 27 的整体低甲基化 (H3K27) 是导致虚假基因表达和肿瘤生长失控的驱动力。这种表观遗传变异源于两种相互排斥的机制：大多数 DMG 中发生的 H3 K27M 突变和 Zeste 增强子同源物抑制蛋白 (EZHIP) 过表达，而几乎所有其余肿瘤中都存在野生型 H3。

由于 DMG 肿瘤位于脑中线结构的重要区域且具有浸润性，手术切除极具挑战性，局部放射治疗 (RT) 是唯一可以延长生命的治疗方法。然而，这种方法对疾病进程的影响微乎其微，因为中位总生存期 (OS) 为 9-11 个月，仅有 2% 的儿童在确诊后存活 5 年。跨越数十年的 250 多项临床试验测试了各种各样的治疗干预措施，包括细胞毒性化疗、放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗，但并未改善患者的预后。因此，迫切需要新的化疗方案来战胜这些普遍致命的肿瘤。

近年来，药物再利用 - 即将美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准的药物用于其最初用途以外的其他用途 - 正在成为一种快速、经济有效的方法，可加快新治疗策略的开发时间表。在这种情况下，甲苯咪唑 (MBZ) 作为最有前途的抗脑癌再利用药物之一而受到关注。它已被证明可作为驱虫药在人类中安全使用 40 多年，并且偶然发现它具有针对动物脑肿瘤模型的抗癌特性。除了众所周知的对快速分裂细胞微管聚合的破坏作用 之外，MBZ 还抑制多种致癌信号通路和癌症相关的细胞过程，例如血管生成和上皮-间质转化，同时引发细胞凋亡和细胞周期停滞。在培养的胶质母细胞瘤 (GBM) 和髓母细胞瘤 (MB) 细胞系中，给予 MBZ 后，细胞存活率的 IC 50从 0.1 到 0.5 μM 不等，该浓度在临床上是可以达到的。体内给予 MBZ 可延长颅内 GBM和 MB小鼠的生存期，同时伴有肿瘤血管减少，但在正常组织中没有这种效果。值得注意的是，对大量带有机制注释的已批准和在研化合物进行体外高通量筛选测试，已将 MBZ 确定为对源自儿童实体瘤 的细胞系（包括 DMG）具有活性的顶级效力筛选药物之一。

因此，由于其作为抗癌剂的广泛作用机制和在临床前环境中已证实的与化疗和放疗的协同作用，以及其在临床环境中的高血脑屏障穿透性和良好的药代动力学和安全性，MBZ 满足用于治疗中枢神经系统肿瘤的再利用药物的许多理想特征。事实上，目前正在成人（NCT01729260）和儿童（NCT02644291，NCT01837862）中进行 I/II 期临床试验，以研究 MBZ 单独或与标准化疗药物联合使用对包括 DMG 在内的脑肿瘤的治疗作用。此外，用于生物标志物指导药物选择的基于计算多组学的方法已将 MBZ 确定为 DMG 患者个性化治疗以阻断特定信号传导或骨干疗法的首选药物之一。

然而，尚未对MBZ在DMG细胞培养中的抗癌特性进行彻底的机制研究。深入了解MBZ抗肿瘤作用背后的细胞和分子过程及其与其他药物的药理相互作用，对于将MBZ纳入更有效的DMG治疗方案至关重要。新兴证据表明，DMG表现出巨大的肿瘤间和肿瘤内异质性，凸显了联合疗法的必要性，以克服克隆多样性和耐药性的发生。

基于这些前提，我们利用细胞存活分析、细胞周期分析和细胞死亡标志物，鉴定了MBZ在一组DMG H3K27M突变和H3野生型细胞系中的作用。此外，我们还进行了联合实验，以探究MBZ在增强DMG细胞对ONC201化学敏感性方面的作用。ONC201是一种前景光明的在研化合物，目前正处于针对H3K27突变型胶质瘤的后期临床试验中，并显示出初步的生存获益。最后，我们重点介绍了MBZ克服ONC201耐药性的能力。

材料和方法

细胞培养和试剂

原代DMG细胞培养模型由斯坦福大学的Michelle Monje博士惠赠。SF8628和SF7761购自默克密理博公司。SF8628细胞在添加10%胎牛血清（FBS）和GlutaMAX-I的杜氏改良Eagle高糖培养基（DMEM）中培养，并在贴壁培养条件下生长。所有其他细胞系均在无血清肿瘤干细胞培养基中生长，该培养基由 Neurobasal-A 培养基和 DMEM/F-12 1:1、N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-（2-乙磺酸）（HEPES）缓冲液、丙酮酸钠、最低必需培养基 (MEM) 非必需氨基酸、抗生素抗真菌溶液、GlutaMAX-I、B-27 补充剂组成，并补充人成纤维细胞生长因子 2 (FGF2)、人表皮生长因子 (EGF)、人血小板衍生生长因子 A (PDGFA)、人血小板衍生生长因子 B (PDGFB)和 0.2% 肝素。

ONC201 抗性变体（称为 SU-DIPG-XIII-R）是通过将亲本系持续暴露于逐步增加的 ONC201 浓度并在始终含有 0.7 µM 选择剂的培养基中维持而建立的。

MBZ和ONC201，溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10 mM的原液浓度。在细胞处理前，使用细胞培养基进行梯度稀释。

细胞活力测定

所有悬浮细胞系均以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，SF8628以1000个细胞/孔的密度接种。24小时后，用DMSO载体或每种药物的梯度稀释液处理细胞72小时。使用CellTiter-Glo测定细胞活力，并使用TECAN成像系统测量生物发光成像。使用 GraphPad Prism 8.00的数据，通过 S 形剂量反应函数计算半数最大抑制浓度 (IC 50)、95% 置信区间 (95% CI) 和最大效应 (E max，定义为最高剂量下的细胞增殖抑制百分比)。

通过自动细胞计数器评估活细胞和死细胞的数量，该计数器通过使用碘化丙啶对细胞核进行染色来区分活细胞和死细胞。

药物组合及协同作用评估

对于联合用药测试，将细胞用每种药物单独或联合处理72小时，并使用CellTiter-Glo检测法评估细胞活力。使用Compusyn软件计算MBZ和ONC201之间的药理相互作用，并基于Chou-Talalay中值效应方程法以联合指数(CI)表示，其中CI值<1表示协同作用，CI>1表示拮抗作用。

为了避免协同效应估计的偏差，我们还使用了 SynergyFinder 3.0 免费网络应用程序，该应用程序能够通过多种协同参考模型量化组合效应，每种模型都是在不同的单药行为假设下制定的，包括 Bliss 过量、Loewe 加性、最高单药 (HSA) 和零相互作用效力 (ZIP) 。常规指标为：拮抗作用<-10；加性，从 -10 到 10；协同作用>10。

流式细胞术

将细胞以适当的浓度接种，以使其在整个实验过程中处于增殖期。24 小时后，用指定浓度的载体或药物对细胞进行 72 小时的刺激。在处理期结束时，收集、解离细胞，然后使用细胞过滤器进行过滤。之后，在涡旋振荡的同时，逐滴加入预冷的 80% 乙醇，使细胞悬浮并固定，并储存在 4°C 下。在分析时，根据制造商的说明使用细胞周期试剂盒对固定的细胞进行染色。在室温下孵育 15 分钟并避免阳光直射后，使用流式细胞术 测量处理样品和对照样品的荧光。

蛋白质印迹法

将SU-DIPG-XLVIII和SF8628接种于合适的培养皿中，24小时后以指定浓度的药物进行不同时间间隔的激发。以溶剂处理的细胞作为对照。处理结束后，收集细胞，用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，并在含有Halt蛋白酶抑制剂混合物的Pierce RIPA缓冲液中破碎。细胞裂解物经预制SDS-PAGE凝胶分离，并转移至硝酸纤维素膜上。将膜用以下一抗在 4°C 下探测过夜：磷酸化 p53，p21 Wafl/Clp1，裂解的 Caspase3，GAPDH，均来自 Cell Signaling Technology； p53，p27 Klp-1和裂解的 PARP来自美国德克萨斯州达拉斯的 Santa Cruz Biotechnology。所有印迹均与相应的辣根过氧化物酶偶联抗鼠IgG或抗兔IgG孵育。免疫反应条带采用增强化学发光法显色。条带密度分析采用Image Lab 6.0.1版软件进行。

细胞凋亡

细胞凋亡分析是通过将适当数量的 SU-DIPG-XLVIII (1×10 6) 和 SF8628 (0.25×10 6) 细胞用不同浓度的处理 72 小时来进行的。在孵育期结束时，收集样品，分离成单个细胞，并根据制造商的说明，用含有异硫氰酸荧光素 (FITC) - Annexin V 结合物和碘化丙啶 (PI) 的死细胞凋亡染色试剂盒 进行染色。在室温下黑暗中孵育 15 分钟后，用流式细胞术测量处理过的样品的荧光。

结果

MBZ抑制DMG细胞增殖

我们评估了 MBZ 在 7 种代表神经球的 DMG 细胞培养物和贴壁模型中的抗增殖作用。SU-DIPG-XIII-P* 和 SU-DIPG-XIII-FL分别来自同一患者的原发性脑桥肿瘤和继发性额叶病变。DMG 组涵盖了肿瘤的完整遗传背景，包括具有 H3.1K27M 的细胞系、野生型 H3 的细胞系和标志性突变 H3.3K27M。通过 CTG 检测法评估暴露于浓度逐渐增加的 MBZ72 小时后的细胞毒性。在 7 个 DMG 细胞系中有 6 个观察到对 MBZ 的剂量依赖性反应，IC 50值从 102 nM 到 958 nM。IC 50中值为 290 nM，而 Emax (%)中值为71%（范围：58% 至 82%）（图1A、1B），这表明与测量到的最小存活率相对应的最大效应。SU-DIPG-VI 细胞对 MBZ 的反应较弱，产生最低的 Emax (35%)。重要的是，我们在体外发现的IC 50值在临床范围内是可以达到的。例如，在最近针对高级别胶质瘤患者进行的 1 期剂量递增研究中，MBZ 的血浆浓度达到 1 μM，具有长期安全性和可接受的毒性。

图1. MBZ 降低 DMG 细胞系的细胞活力。(A) MBZ 对所示 DMG 细胞系影响的剂量反应曲线和 IC 50图形表示（虚线）。药物暴露 72 小时后，通过 CTG 分析测定细胞活力。结果表示三次独立实验（重复三次）中，相对于载体处理对照细胞的细胞活力百分比（平均值±标准差）。(B) IC 50值及其 95% 置信区间和 E max (%)。通过细胞计数测定 SU-DIPG-XLVIII (C) 和 SF8628 (D) 细胞系在等毒性剂量 MBZ 下的细胞活力和细胞死亡率 (%)。用相应的 IC 50（分别为 1 µM 和 0.25 µM）处理细胞 72 小时，然后使用 NucleoCounter 计数活细胞和非活细胞。每个条形图代表三次独立实验的平均值±SD（*P < 0.05；**P < 0.01；平均值±SD；双尾学生 t 检验）。nr：未达到。

为了进一步表征 MBZ 的药理作用，我们通过细胞计数确定了 SU-DIPG-XLVIII（图1C）和 SF8628（图1D）中的细胞活力和细胞死亡，它们对 MBZ 的 IC 50敏感性不同，但 Emax值较高且相当。最近，越来越多的证据表明，野生型和 K27M 突变 H3 的 DMG 具有不同的表观基因组和转录景观，并且治疗策略可能存在差异 ，主张对其化学敏感性特征进行有针对性的临床前表征。MBZ 浓度等于各自的 IC 50值，如预期的那样，两种细胞系中的活细胞数量减少了约 50%，同时非活细胞数量增加了两倍。除非另有说明，所有后续实验均在 MBZ 的这些等效毒性浓度下进行。

MBZ 通过靶向细胞检查点蛋白 p21 和 p27 诱导 DMG 细胞细胞周期紊乱

为了确定细胞停滞与细胞凋亡在 MBZ 诱导的细胞数量减少中的作用，我们评估了 SU-DIPG-XLVIII 和 SF8628 培养物在暴露于相应的 IC 50 24、48 和 72 小时后细胞周期的扰动。总体而言，尽管实体不同，但 MBZ 诱导的细胞动力学特征变化在两种细胞系中相似：在 SU-DIPG-XLVIII 中，在药物暴露 24 小时后即可观察到 S 和 G2/M 期细胞的积累几乎增加了两倍（图2A），在 48 小时时进一步增加并持续长达 72 小时，同时在相应时间点 G0/G1 细胞群明显减少。在SF8628系中，细胞周期分布的变化总体上是适度的（图2B），最明显的影响是24小时至72小时内G2/M区室的增加。

图2.MBZ 改变细胞周期进程和调节蛋白 p53、p27 和 p21 的表达。（A、B）MBZ 对 SU-DIPG-XLVIII (A) 和 SF8628 (B) 细胞系中细胞周期分布影响的时间过程分析。用相应的 IC 50（分别为 1 µM 和 0.25 µM）的 MBZ 处理细胞指定的时间段。通过流式细胞术评估处于细胞周期不同阶段的总细胞群百分比。（C、D）用载体或等毒剂量（IC 50）的 MBZ 处理 24、48 和 72 小时的 SU-DIPG-XLVIII (C) 和 SF8628 (D) 总裂解物的蛋白质印迹分析。用所示抗体探测印迹。GAPDH 用作上样对照。

在相同实验条件下进行的平行蛋白质印迹实验表明，MBZ 以时间依赖性方式上调 SU-DIPG-XLVIII 中的肿瘤抑制蛋白 p53 和 p21 的表达，并且这种效果在暴露 24 小时后就已明显，而 p27 蛋白水平在 48 小时时明显增加，之后达到峰值。p53 在 Ser 15 的磷酸化与 p53 调节一致，这表明 MBZ 促进 p53 转录因子活性，可能导致检查点蛋白（即 p21）的上调和细胞周期停滞（图2C）。在携带 TP53 基因突变的 SF8628 中，p27 和大多数 p21 表现出轻微的时间依赖性上调（图2D），而 p53 及其活化形式均未受到调节，这与观察到的微小细胞周期变化一致。因此，无论 p53 状态如何，MBZ 似乎都能阻断 G2/M 期的 DMG 细胞，尽管在存在野生型 p53 的情况下对细胞周期的影响更为明显。

MBZ 引发 DMG 细胞凋亡

接下来，我们分析了 MBZ 诱导的 caspase 3 活化和聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) 裂解，这是凋亡机制的两个标志。在两种 MBZ 处理的细胞系中，这两种标志物在 24 小时内就呈时间依赖性增加（图3A、3B），表明凋亡过程早期开始。为了进一步研究 MBZ 引发的细胞死亡机制，我们使用 Annexin V-PI 双染技术区分在 SU-DIPG-XLVIII（图3C）和 SF8628（图3D）以 IC 25 s（分别为 500 nM 和 100 nM）和 IC 50 s 处理 72 小时后早期和晚期凋亡和坏死细胞。 MBZ 在两种细胞系中以剂量依赖性方式强效诱导细胞凋亡的两个阶段，并表现出不同的敏感性：在最高等毒剂量下，与相应的对照细胞相比，MBZ 处理的 SU-DIPG-XLVIII 和 SF8628 培养物中的凋亡细胞分别增加了约 10 倍和 4 倍。

图3.MBZ 引发 DMG 细胞凋亡。(A, B) MBZ 对 SU-DIPG-XLVIII (A) 和 SF8628 (B) 中 PARP 裂解和 caspase 3 活化的影响随时间变化。细胞分别暴露于等毒性浓度 (IC 50 ) 的 MBZ 中 24、48 和 72 小时。使用指定抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。(C, D) 使用 Annexin V-FITC 和 PI 染色，对 MBZ 处理的 SU-DIPG-XLVIII (C) 细胞和 SF8628 细胞 (D) 进行流式细胞术分析。将细胞与载体或等毒性浓度 (IC 25和 IC 50 ) 的 MBZ 一起孵育 72 小时。

MBZ 和 ONC201 的组合显示出对抗 DMG 的协同作用

研究表明，MBZ 可与具有不同作用机制的药物（包括烷化剂和分子靶向药物）产生协同作用。迄今为止，尚无研究彻底探究 MBZ 与 ONC201 的组合效应。ONC201 是一种很有前景的在研化合物，目前正处于针对 DMG 和其他癌症的后期临床试验阶段。ONC201 最初被设计为多巴胺受体 D2/3 的双位拮抗剂，随后发现其可激活线粒体酪蛋白水解蛋白酶 P (ClpP) ，并在不同的癌症模型中发挥抗肿瘤活性。

由于 MBZ 和 ONC201 的作用机制不同，我们假设它们的组合可能具有协同作用。为了研究这两种化合物之间的相互作用，我们首先在四种代表性患者来源的 DMG 细胞培养物中生成 ONC201 单独使用以及与亚 IC 50 MBZ 组合使用的药物反应曲线。所有组合均在评估细胞活力之前测试 72 小时。令人鼓舞的是，当与低剂量的 MBZ 组合使用时，ONC201 显示出四条线的剂量反应曲线左移（图4）。这些数据共同表明与 MBZ 组合使用时 ONC201 的疗效增强。

图4.低剂量MBZ可增强ONC201的抗增殖作用。DMG细胞培养物在单独暴露于ONC201（绿线）或与亚IC 50浓度的MBZ（红线）72小时后，细胞活力的剂量反应曲线。通过CTG分析测定细胞活力，并以相对于载体处理对照细胞的百分比表示。MBZ浓度如下：SU-DIPG-XLVIII细胞系为500 nM，其他所有细胞系为100 nM。

接下来，作为后续的确认性筛选，我们进行了棋盘试验，其中每种药物的不同浓度分别在72小时内进行单独和联合用药测试。每块板包含6×5剂量基质稀释的MBZ和ONC201。总体而言，当两种化合物联合使用而非单药治疗时，每种培养物的细胞活力均降低（图5A）。使用CalcuSyn 2.0软件进行联合分析表明，MBZ和ONC201在不同剂量组合和细胞系之间均具有一致的协同作用（CI < 1）（图5B）。

图5.MBZ 和 ONC201 的组合对 DMG 细胞表现出协同作用。(A) 将四份患者来源的 DMG 细胞培养物分别暴露于剂量递增的 MBZ（灰色）、ONC201（绿色）或两者（红色）72 小时后，与 DMSO 对照相比，细胞活力有所降低。(B) 根据 (A) 中各组细胞活力测量值，计算出 MBZ/ONC201 组合在不同剂量下的协同 CI 评分 (CompuSyn 2.0)。水平虚线表示 CI = 1，其中线下方的点表示协同作用，线上方的点表示拮抗作用。

我们利用 Web 应用程序 SynergyFinder 进一步验证了 MBZ 与 ONC201 的组合功效，该应用程序可以计算协同评分，并与四种不同的参考模型进行比较：HSA、Loewe、Bliss 和 ZIP。当使用所有算法进行评估时，MBZ/ONC201 组合在 SU-DIPG-XLVIII（图6A）和 SF8628（图6B）中均具有协同作用（得分>10）。相反，在 SU-DIPG-XIII-P*（图6C）和 SU-DIPG-XIII（图6D）中，所有模型（得分-10到10）均一致发现可加性，但 SU-DIPG-XIII-P* 中的 Loewe 得分为 18.56，SU-DIPG-XIII 中的 HSA 得分为 13.65，显示出强烈的协同作用。在二维协同图中，算法识别出协同得分最高的剂量区域（以白框突出显示），在我们的案例中，这些剂量区域对应于不同品系中每种药物各自 IC 50值附近的剂量。因此，我们选择这些 IC 50值进行后续的分子研究。

图6.使用不同的参考模型计算的 MBZ 和 ONC201 之间的药理相互作用的比较证实了该组合在 DMG 细胞中的协同/相加作用。使用 Synergy Finder 从 SU-DIPG-XLVIII (A) SF8628 (B)、SU-DIPG-XIII-P* (C) 和 SU-DIPG-XIII (D) 中的单个活力测量值（如图5A 所示）分析了 MBZ 和 ONC201 组合的组合抑制作用。每个面板显示 2D 和 3D 协同图以及使用 HSA、Bliss、Loewe 和 ZIP 算法计算的协同分数表。2D 和 3D 协同图分别以红色和绿色突出显示协同和拮抗剂量区域。

与 ONC201 联合治疗可增强 MBZ 在 DMG 细胞系中的促凋亡作用

我们接下来想知道 MBZ 和 ONC201 之间的协同作用是通过增加细胞停滞、增加细胞凋亡还是两种机制共同介导的。为此，SU-DIPG-XLVIII 细胞在产生最高协同评分的 MBZ 和 ONC201 剂量下处理 72 小时。FACS 分析显示，与最有效的单一药物（即单独使用 MBZ）治疗相比，MBZ-ONC201 联合治疗后处于 G2/M 期的细胞百分比甚至更低（图7A）。一致地，MBZ 和 MBZ+ONC201 使 p53 和 p27 蛋白的表达增加到相似程度，MBZ 诱导的 p27 和 p21 上调甚至被组合逆转（图7B）。重要的是，MBZ+ONC201 诱导的 PARP 和 caspase 3 裂解比单独使用任何一种药物都要大得多（图7C）。通过 Annexin V-PI 双重染色获得了类似的数据，表明与单一疗法相比，联合治疗显着增加了凋亡细胞的百分比，同时对坏死细胞的比例影响最小（图7D）。

图7.与 ONC201 联合处理可增强 MBZ 在 DMG 细胞系中的促凋亡作用，同时对细胞周期分布和检查点蛋白的影响最小。（A）MBZ 和 ONC201 单独和联合使用对 SU-DIPG-XLVIII 中细胞周期分布的影响。用载体、MBZ (1 µM)、ONC201 (1.5 µM) 和两种药物处理细胞 72 小时。通过流式细胞术评估处于细胞周期不同阶段的总细胞群百分比。（B、C）在与 (A) 相同的条件下对 SU-DIPG-XLVIII 总裂解物进行蛋白质印迹分析。用针对调节蛋白 p53、p27 和 p21 (B) 和凋亡标志物 (C) 的抗体检测印迹。使用 GAPDH 作为上样对照。 （D）对按照上述（A）方法处理的 SU-DIPG-XLVIII 细胞进行流式细胞术分析，用 Annexin V-FITC 和 PI 染色。

MBZ 克服了 DMG 细胞中的 ONC201 抗性

ONC201 在早期试验（NCT03416530和NCT03134131）中已被证明对患有 H3 K27M 突变型 DMG 的儿科患者有益。然而，约 20%-30% 的非复发性 DMG 患者出现病情进展，这表明在临床使用中经常出现对 ONC201 的内在或获得性耐药性。

为了确定在 ONC201 前期治疗失败后 MBZ 是否可用于二线治疗，我们评估了 ONC201 和 MBZ 在亲本和 ONC201 筛选 (SU-DIPG-XIII-R) 细胞系中的生长抑制作用。在该细胞系中，ONC201 耐药性与 ONC201 靶标 ClpP 水平较低有关（图8A，插图）。ONC201 处理 72 小时后，SU-DIPG-XIII 细胞中的 IC 50为 1.497 µM，与文献数据一致。相比之下，用相同剂量 ONC201 处理的 SU-DIPG-XIII-R 未达到IC 50 ，E max值为 32%，而亲本细胞中为 72%（图8A）。有趣的是，两个品系对 MBZ 的敏感性没有改变，这由 IC 50和 E max的相似值证明，这表明 MBZ 克服了对 ONC201 的获得性抗性（图8B）。

图8.MBZ 克服了 SU-DIPG-XIII-R 中的 ONC201 抗性。(A, B) ONC201 (A) 和 MBZ (B) 对 ONC201 敏感和抗性的 SU-DIPG-XIII 细胞系的抗增殖作用的 IC 50、95% CI 和 E max的图示和表格。药物暴露 72 小时后，通过 CTG 分析测量细胞活力，并以相对于载体处理的对照细胞的百分比表示。nr：未达到。插图(A)，对 SU-DIPG-XIII (WT) 和 SU-DIPG-XIII-R (R) 中 ClpP 和管家 GAPDH 蛋白表达的蛋白质印迹分析。

讨论

非癌症药物在肿瘤学中的应用正在成为一种替代方法，通过降低毒性、增强疗效和对抗耐药性来改善治疗方案。

为了寻找针对 DMG 儿童的新型、更有效的治疗策略，我们研究了重新利用的驱虫药 MBZ 在 DMG 细胞系中的多方面治疗潜力。我们发现，MBZ 通过减缓细胞周期进程和触发细胞凋亡来抑制 DMG 细胞系中的细胞增殖。此前，对 2706 种针对 860 种不同细胞机制的在研和已上市化合物进行了高通量药物筛选，发现 MBZ 是针对 4 种 DMG 细胞系的 371 种最有效药物之一。然而，除了细胞毒性试验之外，没有进行任何其他基于细胞的研究。我们扩展了这组培养物，包括六种迄今为止尚未鉴定出对 MBZ 敏感性的 DMG 细胞系，以及之前报道的 SU-DIPG-XIII，用作参考系。我们发现的IC 50值在已发表的数值范围内，最重要的是，在临床剂量可达到的浓度范围内，从而突出了 MBZ 在临床相关浓度下对大量具有不同遗传背景的 DMG 系（包括 H3 野生型 DMG 模型）的疗效。

MBZ 的抗增殖特性是由 DMG 细胞在 G2/M 期停滞，同时关键细胞周期调节因子 p21 和 p27 的上调所介导的。无论细胞系的 TP53 状态如何，这种上调都会发生，但在携带野生型 TP53 的细胞系中更为明显。除了细胞抑制作用外，MBZ 还能通过触发凋亡相关通路来降低 DMG 细胞存活率。我们的研究结果与多种肿瘤模型的数据一致，在这些模型中，有丝分裂停滞以及随后的 caspase 3 介导的细胞凋亡是 MBZ 诱导的主要抗肿瘤机制之一。

已有记录显示，急性淋巴细胞白血病、胶质母细胞瘤 、三阴性乳腺癌和肺癌会将细胞周期停滞在 G2/M 期，而诱导 S 期的报道却不一致。在胶质母细胞瘤细胞中，MBZ 会通过 p53/p21/细胞周期蛋白 B1 通路以剂量依赖性的方式将细胞周期停滞在 G2/M 期。然而，本研究仅探索了最长 24 小时的短期治疗。重要的是，我们的数据除了证实了在其他肿瘤细胞系（包括脑肿瘤细胞系）中已发表的研究结果外，还记录了 MBZ 一种以前从未报道过的、持久的细胞因子作用，最长可达 72 小时。

尽管 MBZ 的细胞抑制和细胞毒性作用都与功能性 p53 有关，但 p53 突变细胞也会导致凋亡。例如，野生型和突变型 p53 黑色素瘤细胞系均对 MBZ 敏感。同样，MBZ 治疗可使肺癌细胞系中 p53 翻译后稳定，并促进 p21 和 MDM2 的下游表达。然而，暴露于 MBZ 的 p53 缺陷型肺癌细胞也会通过内在和外在途径凋亡，如 caspase-9 和 caspase-8 的激活所表明的那样。同样，无论 p53 状态如何，MBZ 都会抑制卵巢癌细胞培养物的生长。在我们的模型中，无论TP53状态和蛋白质调控如何，MBZ治疗均能诱导细胞周期停滞和凋亡，这表明在DMG中，MBZ的抗增殖/促凋亡反应并非唯一依赖于p53。这些发现对DMG具有重要意义，因为相当一部分肿瘤表达突变型TP53。

由于其多效性，MBZ 很可能通过抑制关键的促存活信号（如 PI3K/AKT 和 RAS/RAF/MEK/ERK）来激活程序性细胞死亡，而这些信号在磷酸化各种凋亡调节因子中发挥重要作用。在黑色素瘤模型中，MBZ 降低 MEK 和 ERK 的磷酸化以及与应激反应和翻译相关的 ERK 下游靶点（包括 ElK1 和 RSK）的磷酸化。在急性髓系白血病细胞 (AML) 中也已证实 MBZ 会导致 ERK1/2 和 AKT 的剂量依赖性低磷酸化，这表明 MBZ 对 AML 细胞的生长抑制活性可能部分是通过抑制这些信号来介导的。在最近的一篇研究报告中，MBZ 诱导的非小细胞肺癌细胞中的 ROS 积累可抑制 STAT3 信号传导并下调 BCL-xl 抗凋亡蛋白，同时上调凋亡标志物。在其他模型中也发现了 MBZ 对抗凋亡蛋白（包括 XIAP 和 BCL2）表达水平的影响。

至于细胞周期进程，据报道，p21 是 MBZ 在许多癌细胞系中抑制生长特性的关键效应因子。然而，其他细胞周期进程蛋白，包括 MYC、MYB、MAF和细胞周期蛋白 D1等，在 MBZ 刺激后会下调。重要的是，已证明 H3K27M 通过表观遗传转录组重塑来驱动癌症，最终导致 RAS/MYC 轴的激活。因此，针对这些通路的 MBZ 靶向治疗可能是 H3K27M 驱动癌症的潜在治疗选择。

到目前为止，单一疗法对于诸如 DMG 等难治性疾病患者而言无疑是无效的，只有 ONC201 在早期试验中显示出了新的临床疗效，据报道，接受 ONC201 治疗的患者的中位 OS 从历史的 11.9 个月显著增加到 21.7 个月。然而，有些儿童最终还是会死亡，有些甚至在前期治疗中就失败了，这表明 DMG 细胞对 ONC201 存在内在和/或获得性耐药性。将具有不同作用机制的药物联合使用以产生协同作用，可优化治疗效果和安全性，并且对于以高度肿瘤内和肿瘤间异质性为特征的 DMG 尤其有益。

为巩固 ONC201 和 MBZ 在治疗 DMG 方面的初步良好疗效，我们探索了这两种化合物组合的治疗潜力。通过剂量反应矩阵设计，我们发现联合治疗在四种 DMG 细胞系中比单一药物具有更大的生长抑制活性，在两种培养物中产生协同作用，在另外两种培养物中产生相加作用。药物间的协同作用因细胞环境和药物类别等几个问题而异，这首先在临床前体内研究中，其次在临床环境中引入了癌症药物组合发现中的偏差和可重复性危机。因此，我们使用基于不同假设开发的四种参考模型验证了 MBZ/ONC201 组合的效果，重要的是，我们发现所有相互作用评分具有高度一致性，进一步证实了这两种化合物的组合功效。

从机制上讲，MBZ/ONC201 联合治疗 DMG 的疗效优于单药治疗，其机制是通过增强凋亡信号传导而非有丝分裂阻滞来实现的，这表现为活化 caspase 3 和 PARP 裂解水平升高，远远超过了单药诱导的这些细胞死亡标志物上调的总和。这可能表明该联合用药触发了两种不同的凋亡途径：ONC201 依赖于 ClpP 依赖的整合应激反应 (ISR) 激活和 TNF 相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 途径的上调，而 MBZ 则触发 caspase 介导的内在和外在线粒体途径的激活。非常重要的是，我们发现，在临床可达到的血清浓度范围内，无论细胞系的H3K27状态如何，MBZ和ONC201的浓度均具有最高的敏感性/加和性评分。尽管ONC201目前正在临床试验中用于治疗携带典型H3K27M突变的DMG，但越来越多的证据表明，对于包括野生型H3DMG在内的多种肿瘤患者，ONC201的给药具有适应症。

迄今为止，一些临床前研究发现 ONC201 与其他药物（例如靶向激酶、表观遗传修饰酶和蛋白酶体的药物）联合使用具有协同作用。最近，ONC201 与 PTC596（一种在研的抗肿瘤小分子，与 MBZ 类似，可以与微管蛋白的秋水仙碱位点结合）的组合已显示出对患者来源的 DMG 培养物强大的协同生长抑制作用，无论其 H3K27M 状态如何。总之，这些研究结果以及我们的研究结果表明，对于持续寻找有效治疗策略来对抗难治性疾病的患者群体来说，共同靶向微管蛋白和 ClpP 可能具有战略意义。

MBZ 能够克服 ONC201 抗性，这表明 MBZ 可能阻断或绕过癌细胞为逃避药物治疗而采取的其他机制。不同的分子机制可能导致 ONC201 抗性，包括 ClpP 蛋白表达水平和/或突变。ClpP 的异位过表达使血癌细胞对 ONC201 敏感，而 CRISPR 敲除导致的 ClpP 缺失则产生抗性。ONC201 抗性也与 ONC201 选择的细胞系中发生的 D190A 突变有关。在我们的 DMG 模型中，长时间暴露于 ONC201 会导致 ClpP 蛋白水平大幅下降，这与 ONC201 敏感性与其靶标 ClpP 表达之间的关系一致。 MBZ 能够规避 ONC201 敏感性降低的一个合理解释是，每种药物的作用机制各不相同，MBZ 靶向微管，而 ONC201 是 ClpP 介导的错误折叠蛋白降解的激活剂。我们的研究结果与其他研究一致，他们证实 ONC201 耐药细胞对其他药物（例如阿霉素和长春新碱）仍具有相似的反应性，后者与 MBZ 一样抑制微管蛋白聚合。

我们研究的局限性在于缺乏临床前体内验证，这妨碍了在更可靠的环境中评估 MBZ 的治疗潜力，因为复杂的肿瘤结构以及药代动力学因素可能会影响药物输送到肿瘤部位以及对药物的反应。这种局限性部分是由于致瘤性 DMG 细胞系数量非常有限，并且它们在体内的生长速度非常慢，这使临床前模型非常繁琐。我们尝试通过使用大量基因不同的 DMG 细胞系来弥补这一局限性，其中大多数在 3D 培养中生长为漂浮神经球，这些体外模型更可靠地类似于体内肿瘤。此外，临床前和临床研究的文献数据证实了 MBZ 和 ONC201 的血脑屏障通透性高，这表明我们的体外结果可能转化为体内结果。

目前，我们正在积极开展研究，以进一步了解MBZ的抗癌作用机制及其临床疗效。尽管MBZ已被证明是一种潜在的新型低毒性DMG治疗药物，但仍有必要在DMG体内模型中开展进一步研究，以确认MBZ的临床前抗肿瘤活性及其与其他药物联合应用的安全性，以便未来将其应用于临床。

结论

据我们所知，本研究首次深入探究了重新利用的MBZ在一组DMG细胞系中的抗癌活性，包括单药治疗以及与ONC201联合治疗。我们的研究为一种新型的潜在联合策略提供了细胞和分子层面的见解，该策略将两种低毒、临床前有效的抗癌化合物结合在一起，在H3K27突变型和H3野生型DMG细胞系中发挥协同生长抑制和促凋亡活性。除了其对ONC201的化学增敏活性外，我们还强调了MBZ作为晚期DMG二线治疗机会的临床前潜力。