2025年6月26日Journal of Medicinal Chemistry

大鼠肉瘤病毒 (RAS) 基因，包括 Kirsten 大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物 (KRAS)、神经母细胞瘤 RAS 病毒致癌基因同源物 (NRAS) 和 Harvey 大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物 (HRAS)，是一类被广泛认可的致癌基因家族。值得注意的是，RAS突变是多种人类癌症中最常见的致癌基因之一。RAS致癌基因的驱动突变主要发生在甘氨酸12位（主要为D、V、C、R和S）、甘氨酸13位（主要为C和D）以及谷氨酰胺61位（主要为R和H）。据了解，美国每年有超过 20 万新患者患有由 RAS 突变引起的肿瘤RAS 突变主要发生在肺癌、结直肠癌和胰腺癌中，并且广泛分布于多种肿瘤类型。RAS蛋白是小GTP酶家族的重要成员。突变的RAS蛋白会阻断GTP水解和/或促进GDP与GTP核苷酸交换，从而加速RAS蛋白从非活性、GDP结合的RAS(OFF)状态转变为活性、GTP结合的致癌RAS(ON)状态。RAS(ON)状态升高会激活下游效应蛋白和相应的信号通路，最终导致细胞增殖和存活异常。

在过去的几十年里，针对 RAS 蛋白的药物研发吸引了学术界和工业界的巨大努力。RAS 蛋白历来被认为是“无药可用”的靶点，直到安进生物技术公司开发的首个 KRAS 抑制剂 sotorasib (AMG-510) 于 2021 年获得美国 FDA 批准，用于治疗携带 KRAS G12C 突变的晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 成年患者。随后在2022年，由Mirati Therapeutics开发的另一种KRAS G12C抑制剂adagrasib（MRTX849）获得美国FDA批准，用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）和结直肠癌（CRC）。目前，几种 RAS 抑制剂，如选择性 RAS(ON) G12C 抑制剂 elironrasib (RMC-6291)以及 RAS(ON) 多选择性抑制剂 daraxonrasib (RMC-6236)正在进行多项临床试验，用于治疗多种 RAS 驱动的癌症。两款选择性 KRAS G12C抑制剂 sotorasib (AMG-510) 和 adagrasib (MRTX849)的临床成功及获批，分别靶向非活性 GDP 结合型 KRAS(OFF) 基因，表明选择性抑制 KRAS G12C基因是针对携带 KRAS G12C突变的非小细胞肺癌 (NSCLC) 和结直肠癌 (CRC) 患者的精准治疗策略。然而，KRAS G12C突变仅占 RAS 驱动型癌症的一小部分，而大多数患者尚无有效的治疗选择，这意味着尚未满足的医疗需求。这些患者对第一代 KRAS G12C (OFF) 抑制剂的疗效不佳，或因治疗后出现继发性 RAS 突变和/或 KRAS G12C开关 II 结合位点的额外突变而产生耐药性。因此，开发针对多种RAS突变体和野生型(WT) RAS的广谱抑制剂，代表着针对RAS成瘾性癌症的一系列创新治疗策略。2025年美国癌症研究协会(AACR)年会强调了这一重要性，并在开幕全体会议上进行了多场关于KRAS的报告和讨论，重点突出了KRAS抑制作为研究重点的领域。

近年来，人们做出了相当大的努力来开发泛 KRAS 抑制剂。迄今为止，已取得了重大进展，这体现在几种新型有前景的泛 KRAS 抑制剂的出现，例如 BI-3706674、LUNA18，LY4066434，和 PF-07934040。这些抑制剂是基于先前报道的共价不可逆 KRAS G12C抑制剂，通过结构改造而开发出来的，它们也能与 KRAS 蛋白开关 I (SWI) 和开关 II (SWII) 区域之间形成的浅口袋结合。与那些选择性不可逆 KRAS G12C抑制剂类似，这类泛抑制剂也优先结合非活性状态的 KRAS（KRAS(OFF)）。有趣的是，Revolution Medicines 发起了一项创新药物研发活动，旨在寻找 RAS(ON) 抑制剂。为此，RMC-4998 和 elironrasib (RMC-6291)两种共价不可逆 RAS G12C (ON) 抑制剂和 RMC-7977，已成功鉴定出一种非共价可逆泛 RAS(ON) 抑制剂，其对突变体和 WT KRAS、NRAS 和 HRAS 变体均具有广谱活性。

为了获得具有良好类药物特性的强效泛 RAS(ON) 抑制剂，Revolution Medicines 经过持续优化努力，发现并开发出临床候选药物 daraxonrasib (RMC-6236)。Daraxonrasib 是一种强效、非共价、多选择性分子胶抑制剂，靶向突变型和野生型 KRAS、HRAS 和 NRAS 变体中的 RAS(ON)。RAS、daraxonrasib 和分子伴侣蛋白环丝氨酸蛋白酶 (CypA) 之间形成三元复合物，从而破坏 RAS(ON) 与其他效应蛋白（包括 BRAF 的 RAS 结合域 (RBD)，BRAF RBD）之间的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)。由于缺乏用于配体结合的活性口袋，直接靶向 GTP 结合型 RAS (RAS(ON)) 一直以来都颇具挑战性。Daraxonrasib 与 CypA 形成二元复合物，重塑其表面，形成一个对 RAS(ON) 蛋白具有高结合亲和力的新形态界面。因此，Daraxonrasib 占据了 RAS(ON) 蛋白原本无特征表面上新形成的复合结合口袋。尽管 Daraxonrasib 是一种超越五规则 (bRo5) 的大环抑制剂，但它表现出良好的类药物特性，例如良好的溶解性、血浆暴露量和口服生物利用度。Daraxonrasib 和其他 RAS(ON) 亲和力抑制剂最初来源于一种天然产物桑菲林 A (Sanglifehrin A)，该化合物对 CypA 具有高结合亲和力。

Daraxonrasib 是通过系统的结构-活性关系 (SAR) 探索和结构优化发现的，该化合物基于先前报道的可逆 RAS 抑制剂化合物1（图1）。化合物1最初被确定为探索非共价可逆三重复合物抑制剂作用的探针。化合物1通过 CypA 结合基序与 CypA结合，并与多种 RAS 突变体形成三元复合物，包括 KRAS G12V、KRAS G12C和 KRAS G12D。尽管 CypA: 1二元复合物对 KRAS G12V 的结合亲和力较弱，但经时间分辨 Förster 共振能量转移 (TR-FRET) 分析测定，足以破坏 KRAS G12V与 BRAF RBD 之间的相互作用（表1）。此项发现表明，利用非共价可逆分子胶抑制剂（三重复合物抑制剂）阻断 RAS 与其效应蛋白（如 BRAF）之间的相互作用是可行的。此外，1还表现出弱的阻断 BRAF RBD 与 KRAS G12V以外的其他 RAS 蛋白相互作用的活性，包括多种致癌突变体和 WT KRAS、NRAS 和 HRAS 蛋白。通过 SPR 分析确定结合亲和力（KD1和 KD2）。TR-FRET 生物医学分析用于评估合成化合物对抗 RAS G12V、G12C 和 G12D 以及 KRAS WT 变体与 BRAF RBD 之间相互作用的效力。采用基于细胞的CellTiter-Glo增殖实验评估合成化合物对携带KRAS G12C突变的H358细胞（一种人类非小细胞肺癌细胞系）、携带KRAS G12D突变的AsPC-1细胞（一种人类胰腺癌细胞系）和携带KRAS G12V突变的Capan-1细胞（一种人类胰腺导管腺癌(PDAC)细胞系）的抗增殖活性。1与CypA和RAS SWI/SWII区域之间形成的复合口袋结合。1与RAS残基之间的主要相互作用在RAS突变体和野生型变体之间是保守的。首先在1的右侧(RHS)进行基于结构的构效关系(SAR)探索，以降低其肽类特征(图1）。化合物1的RHS链主要与RAS的SWI和P环区域相互作用。由此鉴定出化合物2 ，其对多种RAS(ON)突变体表现出与化合物1相当的二元复合物(CypA: 2 )结合亲和力，包括KRAS G12V GMPPNP结合、KRAS G12C GMPPNP结合和KRAS G12D GMPPNP结合。经TR-FRET分析测定，化合物2的结合亲和力足以破坏多种RAS突变体与效应子BRAF RBD之间的相互作用。与二元复合物结合亲和力一致，2在 KRAS 突变癌细胞系中表现出相当的抗增殖活性，包括 Capan-1 KRAS G12V、H358 KRAS G12C、AsPC-1 KRAS G12D和 H1975 KRAS WT EGFR mut。

图1

图1. 达拉松拉西布 (RMC-6236) 是一种强效非共价 RAS(ON) 分子胶抑制剂，目前正处于多项临床试验阶段，其药物发现和开发阶段。达拉松拉西布与人 KRAS 和 CypA 复合物的共晶体结构（三元复合物）(PDB ID:9BG6) 显示（为清晰起见隐藏了 CypA）。 Daraxonrasib 与 KRAS G12V蛋白的 SW（SWI 和 SWII）区结合并形成几种关键相互作用，包括氢键、疏水相互作用、π-π 堆积相互作用和范德华相互作用。 （A）在 SWI 区域：daraxonrasib 通过环丙基和噻唑基团与 KRAS G12V蛋白中的 Pro34（P34）残基形成疏水相互作用。 daraxonrasib 的吲哚核心与 KRAS G12V蛋白中的 Ile36（I36）残基之间形成了额外的疏水相互作用。 （B）在 SWII 区域的相互作用：daraxonrasib 分别通过吲哚核心和三唑基团与 KRAS G12C蛋白的 Ala59（A59）（侧链甲基）和 Gln61（Q61）残基形成疏水相互作用。噻唑环还与Tyr64 (Y64)残基的羟基形成水介导的氢键相互作用。达拉松拉西布通过吲哚核心和吡啶环与KRAS G12C蛋白侧链Tyr64 (Y64)残基形成π-π堆积相互作用。暴露于溶剂区的4-甲基哌嗪基团与Met67 (M67)残基形成范德华相互作用。KRAS G12V蛋白以卡通形式显示。氢键以红色虚线突出显示，疏水相互作用以紫色虚线突出显示。达拉松拉西布以绿色棒状显示。人KRAS G12V蛋白中的关键氨基酸残基Pro34 (P34)、Ile36 (I36)、Met67 (M67)、Tyr64 (Y64)、Gln61 (Q61)和Ala59 (A59)以黄色棒状显示。水分子显示为一个红色的球。

表1. 化合物 1–3 和 Daraxonrasib (RMC-6236) 的效力和类药特性

在获得最佳RHS部分后，对2的中心环进行结构优化，以改善与CypA和RAS的相互作用（图1). 采用包括芳香环和饱和脂肪环在内的多个部分来取代大环内的中心苯基（图1）。因此，用噻唑环代替化合物2中的苯环的化合物3对 CypA 表现出显著增强的结合亲和力，并且对 KRAS G12V GMPPNP 结合、KRAS G12C GMPPNP 结合和 KRAS G12D GMPPNP 结合的二元复合物结合亲和力略有改善。增强的结合亲和力（KD1和KD2 ）成功地转化为在多种RAS驱动癌细胞系中显著提高的抗增殖活性，包括Capan-1 KRAS G12V、H358 KRAS G12C、AsPC-1 KRAS G12D和H1975 KRAS WT EGFR mut（表1）。CypA结合亲和力的提高归因于噻唑环和CypA之间氢键相互作用的增强和增强，这可以通过CypA和KRAS G12V蛋白与2复合的三元共晶体结构得到证实（PDB ID：9BG4) 和3 (PDB ID:9BG1）。值得注意的是，CypA- 3 -RAS三元复合物破坏多种RAS变体与BRAF RBD之间相互作用的能力与二元复合物（CypA- 3）对相应RAS突变体的结合亲和力具有良好的相关性。这一发现表明RAS-BRAF RBD破坏试验适用于效力评估，并可指导SAR探索。

尽管3表现出显著改善的结合亲和力和细胞效力，但其进一步发展在很大程度上受到较差的类药性质的限制，包括表观渗透性、小鼠肝微粒体稳定性、溶解度和小鼠口服生物利用度。为了提高3的类药性质和效力，进一步针对 RHS 和 LHS 进行了结构优化，从而确定 daraxonrasib (RMC-6236) 是进一步研究的有希望的候选药物（图1）。Daraxonrasib 含有一个连接到左侧吡啶环上的哌嗪部分。左侧哌嗪部分暴露于溶剂区，与多种 RAS 变体的 CypA 和 SWII 区域相互作用。哌嗪基团与 CypA 中色氨酸残基 121 形成新的阳离子-π 相互作用，如三复合物共晶结构daraxonrasib (RMC-6236) 与 CypA 和 KRAS G12V复合物的引入有助于显著提高 CypA 结合亲和力并破坏多种 KRAS-BRAF RBD 相互作用这种增强的效力成功地转化为显著改善的细胞效力，包括降低 ERK (pERK) 的磷酸化和 Capan-1 KRAS G12V、H358 G12C和 AsPC-1 G12D 中的细胞增殖。此外，与3相比，daraxonrasib 具有显著改善的水溶性和细胞通透性，这归因于 4-甲基哌嗪基团的掺入。重要的是，daraxonrasib 在体外和体内均表现出良好的代谢稳定性。值得注意的是，daraxonrasib 在多个物种中均具有可接受的口服生物利用度，包括小鼠、大鼠、犬和食蟹猴。总体而言，通过对右侧（中心苯环）和左侧（位于 RAS 的 SWII 区域）进行合理的结构修饰而获得的 daraxonrasib 表现出显著改善的药效（蛋白结合亲和力和细胞活性）和类药特性（例如溶解度、渗透性、代谢稳定性和口服生物利用度）。此外，daraxonrasib 的心脏毒性较低，对 hERG、人类 L 型钙通道和人类钠通道。此外，daraxonrasib 对一系列药理学靶点（包括 GPCR、酶、离子通道、核激素受体和单胺转运体）表现出可忽略不计的脱靶效应。与先前报道的三重复合物抑制剂类似，daraxonrasib 可与 CypA 和 RAS 的 SW区域之间形成的复合结合口袋结合，daraxonrasib、CypA 和 KRAS G12V的三元共晶结构与 SW区域结合并形成几种关键相互作用，包括氢键、疏水相互作用、π-π 堆积相互作用和范德华相互作用（图1）。在SWI区，daraxonrasib通过环丙基和噻唑基团与KRAS G12C蛋白的Pro34残基形成疏水相互作用。吲哚核心与KRAS G12C蛋白的Ile36残基形成额外的疏水相互作用。在SWII区，daraxonrasib分别通过吲哚核心和三唑基团与KRAS G12C蛋白的Ala59和Gln61残基形成疏水相互作用。噻唑环还与Tyr64残基的羟基形成水介导的氢键相互作用。daraxonrasib通过吲哚核心和吡啶环与KRAS G12C蛋白的侧链Tyr64残基形成π-π堆积相互作用。暴露在溶剂区域的 4-甲基哌嗪基团与 Met67残基形成范德华相互作用。RAS 的致癌突变通常发生在残基 G12、G13 或 Q61 上。Daraxonrasib 的侧链较短，无法延伸至 RAS 的 P 环，导致由残基 G12、G13 和 Q61 组成的凹槽处于空置状态。这一结构基础有力地支持了 Daraxonrasib 对多种 RAS 突变体和野生型 RAS 具有相似的结合亲和力。此外，Daraxonrasib 和 CypA 仅与 RAS 保守的效应子结合环相互作用。因此，Daraxonrasib 可以有效结合所有 RAS(ON) 亚型，包括突变型和野生型 HRAS、KRAS 和 NRAS，而不会受到远离结合界面的突变残基的影响，这表明其在克服 KRAS 耐药性方面具有巨大的潜力。

在BALB/c裸鼠的MIA PaCa-2 ( KRAS G12C/G12C )异种移植瘤模型（一种胰腺癌(PDAC)肿瘤模型）中，进一步研究了Daraxonrasib的药效动力学(PD)评估。单次口服Daraxonrasib（3、10或25 mg/kg，8小时）显著且剂量依赖性地抑制了DUSP6 mRNA水平，与对照组相比，最大抑制率分别为93%、95%和98%。此外，Daraxonrasib（25 mg/kg，口服）持续抑制AMPK通路48小时，而MIA PaCa-2肿瘤小鼠的低剂量组则出现了通路重新激活。 Daraxonrasib对RAS信号通路的深度持续抑制，在PDAC异种移植小鼠模型以及NSCLC异种移植小鼠模型中转化为显著的剂量依赖性抗肿瘤活性。Daraxonrasib（25 mg/kg，口服，每日一次）耐受性良好，对小鼠体重变化无明显影响。总之，Daraxonrasib在多种携带不同KRAS突变体的肿瘤模型中均表现出强大的体内抗肿瘤活性，同时毒性较低。

综上所述，daraxonrasib 优于专门针对 KRAS G12C、 KRAS G12D或 KRAS G12V的选择性 KRAS 突变抑制剂。首先，daraxonrasib 对突变型和野生型 KRAS、HRAS 和 NRAS 亚型均具有广谱活性。其次，daraxonrasib 显示出克服由继发性 RAS突变或 KRAS G12C SWII 结合口袋突变引起的对第一代 KRAS G12C (OFF) 抑制剂（例如 sotorasib (AMG-510) 和 adagrasib (MRTX849)）的耐药性的潜力。第三，daraxonrasib 是一种非共价抑制剂，共价药物常见的脱靶毒性或超敏反应可忽略不计。 Daraxonrasib 目前正处于两项 III 期临床试验（NCT06625320；NCT06881784），分别用于治疗先前接受过治疗的转移性 PDAC 患者和 RAS 突变的 NSCLC 患者。最近，已报道了对 RAS(ON) 和 RAS(OFF) 形式具有可调亲和力的非共价可逆小分子多变量 RAS 抑制剂。开发针对多种致癌 KRAS 突变，同时保留野生型 HRAS 和 NRAS 基因的下一代 KRAS 抑制剂，将催生新一波精准 KRAS 抑制剂，并有望提供广谱活性和良好的安全性。我们期待达拉松拉西布临床试验取得令人鼓舞的结果，但针对 RAS 蛋白活性状态的 RAS(ON) 治疗策略或许能催生出新的药物，以应对 KRAS 耐药性，并更有效地治疗 RAS 依赖性癌症。