摘要

胶质瘤是中枢神经系统的一种高侵袭性、高发性脑恶性肿瘤。尽管诊断和治疗方法取得了实质性进展，但胶质瘤患者的预后通常较差。肿瘤免疫学的突破性发现带来了创新有效的免疫治疗策略来治疗甚至治愈癌症患者；然而，胶质瘤免疫治疗的疗效令人失望。不满意的结果可以通过局部免疫抵抗、血脑屏障 (BBB)、空间异质性和免疫特化的胶质瘤微环境等来解释。纳米工程免疫疗法的出现改变了临床前和临床环境下胶质瘤免疫治疗的模式。纳米技术帮助免疫治疗药物穿过 BBB，并在局部和系统地打开免疫开关，增强针对胶质瘤的肿瘤浸润效应免疫细胞。本文总结并强调了健康脑免疫学以及胶质瘤相关局部和全身免疫抑制方面的知识进展。本文讨论了免疫治疗方法的临床发展，例如治疗性胶质瘤疫苗、树突状细胞疫苗、免疫检查点阻断、过继细胞疗法和新的免疫靶点。本文阐明了纳米技术赋能的胶质瘤免疫治疗在临床前和临床研究中的应用，并展望了未来将纳米工程免疫疗法应用于胶质瘤临床治疗的可能性。

1 简介

胶质瘤是中枢神经系统 (CNS) 的原发性恶性脑肿瘤，具有高死亡率和复发率，其中胶质母细胞瘤为 IV 级星形细胞瘤，是最具侵袭性的形式。尽管有手术、化疗、放疗和新的肿瘤治疗领域的标准治疗方法，但确诊为胶质瘤的患者的平均生存期仍难以提高（胶质母细胞瘤患者约为 8-15个月）。鉴于胶质瘤的高度侵袭性和脑的解剖结构，几乎无法实现准确切除，导致高复发率。受到由致密毛细血管内皮细胞 (EC)、完整的基底膜、周细胞和星形胶质细胞组成的血脑屏障 (BBB) 的保护，胶质瘤细胞对常规化疗药物的反应性不佳。因此，制定有效治疗胶质瘤的替代策略仍然是一个紧迫的挑战。

免疫疗法最早由 William Coley 在 19 世纪 90 年代描述，在过去十年中，免疫疗法在临床癌症治疗中取得了显著成功，它通过训练和增强患者的免疫系统来消灭癌细胞。例如，利用嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞的过继细胞转移疗法可以治愈淋巴细胞白血病患者，并使其缓解十年之久。肿瘤免疫学研究的发现带来了免疫疗法的创新策略，包括癌症疫苗、免疫检查点抑制剂 (ICI) 和 T 细胞疗法。然而，癌症免疫疗法的反应很大程度上取决于肿瘤的特性，临床上有反应的比例很小。神经胶质瘤在免疫学上不同于身体其他部位的恶性肿瘤。此外，血脑屏障（BBB）的保护限制了免疫细胞和刺激剂从外周免疫系统获取的可及性，从而改变了免疫治疗的临床疗效。加深对大脑和外周免疫系统之间动态相互作用的理解，对于开发有效的免疫治疗干预措施至关重要。

1921年，Shirai首次发现移植到异源动物脑内的大鼠肿瘤生长良好，而接种在身体其他部位的肿瘤则被宿主免疫系统排斥。Murphy和Tansley观察到类似的结果，即移植的异位组织在脑内具有良好的耐受性，逃避了免疫系统的致敏。1948年，Medawar提出脑缺乏淋巴引流，因此移植的非自体组织不会引发抗原特异性T细胞免疫介导的排斥反应。Medawar首次提出了中枢神经系统“免疫豁免”的概念。很长一段时间以来，脑被认为是一个与免疫系统完全分离的器官。自20世纪80年代以来，越来越多的证据揭示了脑与外周免疫系统之间存在着积极的通讯。例如，发现抗原物质或 T 细胞通过穿过筛板和鼻粘膜下层从脑脊液流出到颈部淋巴结 (LN)。2015 年，Louveau 等人首次发现沿硬脑膜窦的功能性淋巴管。这些血管使免疫细胞和液体成分能够引流到颈部淋巴结，并受脑膜淋巴管控制。这一脑免疫基础科学的突破性发现带来了一种新观点，即大脑受到边界免疫细胞的监控和保护。这一发现也有助于解释 100 年前 Shirais 小鼠研究中观察到的一个细节，即植入靠近心室的大鼠肿瘤未能存活，其中足够的抗原被冲洗出来以引起针对移植肿瘤的强烈免疫反应。自 2015 年以来，研究人员一直在探索与大脑紧密交织的免疫细胞的详细区域、功能和特性。例如，Rustenhoven 等人最近发现，中枢神经系统衍生的抗原被硬脑膜抗原呈递细胞 (APC) 识别和处理，随后抗原呈递给硬脑膜窦附近的 T 细胞，强调大脑始终处于免疫检测状态。从免疫学上的“特权”转变为“独特”的态度现在在神经免疫学研究界盛行。对脑免疫的逐渐深入理解巩固了胶质瘤免疫治疗的基础，尽管我们仍不完全了解边缘周围的免疫细胞究竟如何与大脑对话。

与此同时，大量证据表明，至少 1D 纳米级（1-100 纳米）的纳米材料已经改变了癌症免疫疗法，许多产品已进入临床试验阶段。就神经胶质瘤而言，纳米材料由于其体积小、脂溶性、生物源特性和表面功能性，可帮助免疫治疗药物跨越脑屏障。此外，工程纳米材料允许共同递送神经胶质瘤抗原和疫苗佐剂 ，以及靶向递送免疫检查点抑制剂 (ICI) 或免疫刺激剂（如激动剂、细胞因子、或免疫原性细胞死亡 [ ICD ] 诱导剂）。一些先进的纳米免疫治疗候选药物（如 ClinicalTrials.gov 标识符：国家临床试验 (NCT)04573140）已被安排进行临床研究，为神经胶质瘤免疫治疗开辟了新的途径。

鉴于神经免疫学基础科学的进步和纳米材料在医学中的应用，现在是纳米免疫疗法发展以改善胶质瘤治疗的激动人心的时刻。几篇优秀的评论文章及时概述了这一领域，主要侧重于胶质母细胞瘤治疗中的免疫疗法、胶质母细胞瘤免疫调节的微米和纳米策略、脑免疫 、免疫疗法和纳米医学。这篇评论首先简要描述了目前对胶质瘤免疫微环境的理解，然后总结了免疫疗法的临床进展和胶质瘤治疗的潜在新免疫靶点。我们重点介绍了纳米技术介导的胶质瘤免疫疗法的临床前和临床发展（图1），通过将治疗性疫苗靶向输送至淋巴器官或将免疫调节剂靶向输送至胶质瘤部位，或联合治疗。本文详细讨论了纳米工程策略介导免疫以增强疗效的分子和细胞机制。最后，我们展望了如何加速纳米免疫疗法在胶质瘤患者中的临床转化，例如探索脑内驻留免疫细胞的异质性亚群，并追踪胶质瘤进展和纳米免疫疗法治疗过程中免疫细胞与脑之间的动态相互作用。本综述及时总结了纳米技术、神经免疫学和肿瘤免疫学等跨学科领域的最新进展，旨在改进胶质瘤的治疗。

图1 a) 纳米工程策略示意图，旨在增强胶质瘤免疫治疗，将治疗性疫苗靶向递送至淋巴器官（例如淋巴结 [LN] 和脾脏），帮助免疫载体穿过血脑屏障 (BBB) 到达 b) 肿瘤部位，或 c) 联合治疗

2 健康脑免疫学和胶质瘤相关免疫抑制

人们花了几十年的时间才认识到大脑是一个免疫特化的器官，而不是一个特权器官。大脑结构和血脑屏障限制了外来入侵者和在外周系统循环的免疫细胞的进入，也使得识别调节大脑免疫反应的淋巴系统变得困难。随着技术的进步，研究人员已经发现了驻留在大脑内部或边缘的异质性免疫细胞群，它们保护健康的大脑免受传染病的侵害（图2）。免疫细胞来自颅骨和椎骨中的骨髓微环境。脑膜包含相互连接的淋巴管和静脉窦，为免疫细胞和大脑之间的交流奠定了基础。当脑组织受损时，危险信号会进入脑膜中的脑脊液循环，脑脊液可以通过骨化的通道流入颅骨的骨髓腔。颅骨骨髓中的干细胞可感知并响应迁移的信号，分化为专门的免疫细胞，这些免疫细胞将返回脑脊液以保护大脑。信号还将通过上矢状窦进入矢状窦旁硬脑膜，进入硬脑膜淋巴管，并聚集在硬脑膜窦中，在那里被循环免疫细胞识别。除了循环髓系细胞外，脑内还有常驻免疫细胞和硬脑膜窦衍生的免疫细胞，包括大量的小胶质细胞、丰富的血管周围巨噬细胞和有限的 T 细胞。小胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的骨髓细胞，在神经元的发育、先天免疫的识别和脑组织的修复中发挥重要作用。与小胶质细胞源自同一祖细胞的血管周围巨噬细胞和中枢神经系统相关巨噬细胞可以增强血脑屏障 (BBB) 的功能并防止过度炎症。来自鼻窦的 T 细胞迁移到脑膜以监测免疫信号，然后通过淋巴管排出。在循环过程中，T 细胞不仅执行免疫监视，还促进原位小胶质细胞的成熟。在骨髓中产生并环绕大脑边缘的多种免疫细胞对于保护健康的大脑至关重要。

图2 该示意图展示了目前对脑免疫学的理解。大脑拥有自身的免疫系统，其中存在小胶质细胞，T细胞和巨噬细胞位于脑边界。免疫细胞可以通过脑后部的功能性淋巴管从窦道运输至颈部淋巴结。

胶质瘤是典型的“冷肿瘤”，其特征是肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和其他效应免疫细胞频率低。疫苗接种策略几乎不会增加胶质瘤中浸润的 T 细胞数量，这些效应 T 细胞通常处于耗竭状态。了解分子和细胞水平上胶质瘤免疫抑制的详细机制是确定胶质瘤免疫治疗潜在治疗靶点的关键。抑制性胶质瘤微环境主要是由固体外壳引起的，在固体外壳中，对炎症刺激的反应和适应性免疫的诱导受到严格调控。这种调节涉及胶质瘤细胞与周围环境通过直接接触以及细胞因子、趋化因子或细胞外载体进行的异质性通讯。例如，脑中的基质细胞通过大量产生免疫抑制细胞因子（如转化生长因子 β (TGF-β) 和白细胞介素 (IL)-10）抑制对神经胶质瘤细胞分泌的炎症线索的反应。

髓系细胞作为最丰富的有核造血细胞，是胶质瘤免疫抑制的主要调控因子。未成熟状态的髓系细胞在正常情况下常分化为树突状细胞 (DC)、巨噬细胞和粒细胞。然而，一些调控分子在病理条件下抑制髓系细胞的成熟，导致由粒细胞和单核细胞亚群组成的髓系抑制细胞 (MDSC) 的发育。MDSC 通过多种复杂的、依赖于性别的途径阻断肿瘤特异性 T 细胞和自然杀伤细胞的活性。例如，来自人体胶质瘤的外泌体 miR-1246 通过双特异性磷酸酶 3/细胞外信号调节激酶通路促进单核细胞 MDSC的分化和抑制作用，尤其是在缺氧条件下。

除了 MDSC 之外，肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)、调节性 T 细胞 (Treg) 和中性粒细胞也在肿瘤周围募集。TAM 是丰富的免疫细胞，占基质细胞的 30% 到 50%。在此过程中，小胶质细胞中参与感知肿瘤细胞、宿主防御和肿瘤杀伤的基因表达下调，而促进肿瘤增殖的基因表达上调。T 细胞是介导肿瘤细胞裂解的关键效应细胞，它们通过分泌细胞毒性干扰素 (IFN)-γ 、肿瘤坏死因子-α (TNF -α )、颗粒酶和穿孔素来介导肿瘤细胞裂解，而浸润的效应 T 细胞的频率有限，并且它们的细胞毒功能通常在神经胶质瘤环境中受损。通常，表达鞘氨醇-1-磷酸受体 1 (S1PR1) 的新生成的 T 细胞对淋巴结、脾脏和血液中的鞘氨醇-1-磷酸具有很强的亲和力，这驱使 T 细胞从胸腺或骨髓迁移到血液循环系统和淋巴器官。在神经胶质瘤和其他颅内肿瘤模型中，幼稚 T 细胞降低了 S1PR1 的表达，因此被隔离在骨髓中而不是前往肿瘤部位。此外，神经胶质瘤细胞产生抑制分子（例如 TGF- β和 IL-10），促进 Treg 的浸润，从而显著抑制肿瘤特异性 T 细胞的活化。

总而言之，异质性免疫细胞群与胶质瘤细胞和基质细胞相互作用，介导胶质瘤生长的免疫抑制环境，并抵抗免疫系统对胶质瘤的感知。人们一直在深入探索旨在逆转免疫抑制途径的各种免疫疗法，以增强胶质瘤的治疗效果。

3 胶质瘤免疫治疗的临床研究

3.1 治疗性胶质瘤疫苗

治疗性疫苗代表着一种很有前景的癌症免疫疗法，但目前仍处于临床研究阶段。癌症疫苗通常由精选的肿瘤抗原和佐剂组成，佐剂可促进 APC（主要是树突状细胞）的活化和抗原呈递，从而引发针对现有肿瘤细胞的抗原特异性免疫反应。肿瘤抗原通常分为两类：1) 肿瘤特异性抗原 (TSA)，仅在肿瘤细胞上表达，在健康细胞中完全不存在，包括非同义突变产生的新抗原和病毒抗原；2) 肿瘤相关抗原 (TAA)，在肿瘤细胞中水平上调，但在正常细胞中表达水平仍然很低，包括发育特异性抗原和组织特异性抗原。在超过 80% 的胶质母细胞瘤中检测到病毒衍生的抗原，是一种很有吸引力的抗原候选物。

外源性癌症疫苗注射后，佐剂会促进树突状细胞（DC）成熟。成熟的树突状细胞（DC）吸收、加工抗原，然后将其呈递至主要组织相容性复合体 (MHC) I 类和 MHC II 类分子上（图3）。携带抗原的树突状细胞（DC）迁移至引流淋巴结 (dLN)，通过识别 T 细胞受体 (TCR) 和共刺激受体来启动幼稚 T 细胞。迁移的树突状细胞可以将获得的抗原从周围转移到淋巴结驻留的树突状细胞（DC），从而激活 T 细胞。肿瘤细胞通过泛素化和蛋白酶体降解过程来加工内源性抗原蛋白，并被细胞质和内质网中的肽酶切割。衍生的表位被限制性地呈递于肿瘤 MHC I 类分子上，这些表位可以通过 MHC I 类 TCR 结合被疫苗诱导的抗原特异性效应 T 细胞识别。激活的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）直接杀死肿瘤细胞，而T辅助细胞1（Th1）对于CTL的存活、增殖和效应功能以及记忆CTL的产生是必不可少的。

免疫遗传性胶质瘤抗原的鉴定和选择是癌症疫苗成功的关键决定因素。临床研究已广泛探索了几种用于治疗胶质瘤的疫苗抗原。例如，Wilms 肿瘤基因 1 (WT1) 已被证实是胶质瘤以及其他血液系统和实体恶性肿瘤的 TAA，临床研究表明 WT1 肽疫苗能够诱导针对抗原的免疫反应。在一项 I 期临床研究中，复发性恶性胶质瘤患者同时接受了杀伤性人类白细胞抗原 (HLA) I 类表位和辅助性 HLA II 类表位 (UMIN000003506) 的免疫，结果显示 CTL 诱导作用增强。另一种名为IMA950的多肽疫苗由九种HLA I类TAA、两种HLA II类限制性肽和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（NCT01222221）或聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸（NCT01920191）佐剂配制而成。[68]接受IMA950免疫的胶质瘤患者表现出良好的耐受性和CD8+T细胞免疫反应。

与TAA相比，TSA具有免疫原性高、特异性强、对T细胞亲和力强、引起全身炎症的可能性低等优点。表皮生长因子受体变体III（EGFRvIII）是一种基于特异性突变蛋白的TSA，目前正处于临床后期开发阶段。30%的胶质瘤患者体内存在EGFRvIII，它能够持续激活大鼠肉瘤和磷酸肌醇3-激酶通路，导致细胞异常生长。针对EGFRvIII的疫苗是治疗胶质瘤的一种有前景的方法。例如，一项III期随机试验（NCT01480479）显示，针对EGFRvIII的肽疫苗rindopepimut联合化疗药物替莫唑胺（TMZ）可改善新诊断胶质母细胞瘤患者的生存期，但单独使用rindopepimut并不能延长患者的生存期。另一项样本量较小的 II 期研究 (NCT01498328) 表明， rindopepimut 疫苗与贝伐单抗（一种抑制血管生成的治疗性单克隆抗体 (mAb)）联合治疗可延长生存期，这与疫苗介导的抗 EGFRvIII 抗体有关。

异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 突变与 70% 的 II 级和 III 级胶质瘤以及 10% 的继发性胶质母细胞瘤的肿瘤代谢有关，这些肿瘤被定义为有希望的治疗靶点。IDH1 (R132H) 含有可呈递于 MHC II 类分子上的新表位，因此 IDH1 是一种正在临床评估中的替代性 TSA 疫苗。IDH1 疫苗最近的 I 期临床研究表明，在 R132H 突变的 III 级和 IV 级胶质瘤患者中，该疫苗具有免疫原性和副作用，但程度低于 1 级。H3.3K27M最近被定义为另一种 TSA，已进入弥漫性内在性脑桥胶质瘤 (DIPG) 患者的临床试验。及时识别个体患者的肿瘤特异性突变对于生成新抗原疫苗至关重要。

人们一致认为，树突状细胞疫苗是治疗胶质瘤的一种安全可靠的免疫治疗方式，其中将含有负载或脉冲肿瘤抗原的树突状细胞的疫苗回输到患者体内以启动 T 细胞活化。2010 年，美国食品药品监督管理局 (FDA) 首次批准树突状细胞疫苗用于治疗前列腺癌患者。从那时起，树突状细胞疫苗进入了大量临床研究，以评估其治疗其他不同肿瘤的有效性。胶质瘤裂解物通常用于治疗胶质瘤的树突状细胞疫苗中。例如，Audencel 是一种用胶质瘤裂解物脉冲的树突状细胞疫苗，在一项 II 期随机试验 (NCT01213407) 中在新诊断的胶质母细胞瘤患者中引发了有效的免疫反应，尽管这种疫苗并没有使患者的总体生存率受益。胶质瘤免疫抑制会阻碍树突状细胞疫苗的作用，因此树突状细胞疫苗和 ICI 的联合策略可以提高免疫治疗效果。 DCVax-L 是另一种正在进行临床研究用于治疗胶质瘤的自体树突状细胞疫苗。受到 I/II 期临床试验良好结果的鼓舞，DCVax-L 于 2007 年进入 III 期临床试验 (NCT00045968)。该临床试验的早期结果显示 DCVax-L 是安全的，最近发表的报告证实，在标准治疗中添加 DCVax-L 可显著延长胶质母细胞瘤患者的生存期。DCVax -L 在临床上具有巨大的应用潜力。除肿瘤细胞裂解物外，还可以通过用干细胞裂解物脉冲来开发树突状细胞疫苗，这在胶质瘤患者中显示出有效的临床免疫反应。超过 90% 的胶质母细胞瘤中表达的巨细胞病毒磷蛋白 65 (pp65) 已被用于生成 DC 疫苗，一项II期临床研究 (NCT02366728) 观察到，接种巨细胞病毒特异性 DC 疫苗可使近三分之一的胶质瘤患者存活很长时间。

3.2 免疫学和免疫学

使用胶质瘤抗原进行治疗性疫苗接种的有效性常常受到胶质瘤局部微环境中免疫抑制免疫细胞或分泌的抑制分子的影响。肿瘤免疫学的进展通过识别肿瘤发展过程中肿瘤和/或免疫细胞上表达的抑制性生物标志物，彻底改变了癌症免疫疗法。这些标志物抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤免疫逃逸。基于治疗性 mAb 的 ICI 被开发出来以阻断这些免疫抑制检查点，使效应免疫细胞能够攻击肿瘤细胞。第一个靶向 ICI 的细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4) 可以与 T 细胞上的共刺激分子 CD28 竞争结合 B7 配体，从而削弱 T 细胞活化。1996 年，研究人员发现，使用抗 CTLA-4 mAb 会导致小鼠的移植物免疫排斥。几年后，一种名为伊匹单抗（ipilimumab）的抗 CTLA-4 mAb 获得 FDA 批准，用于治疗晚期黑色素瘤，并取得了明显的临床疗效。临床研究成功后不久，免疫检查点抑制剂（ICI）已在临床环境中得到广泛评估，用于治疗其他肿瘤患者。

淋巴细胞上表达的程序性死亡受体 1 (PD-1) 与非淋巴组织上的程序性死亡配体 1 (PD-L1) 和 PD-L 2 相互作用，主要通过含有 Src 同源性 2 结构域的酪氨酸磷酸酶 2 抑制外周 T 细胞的活化。阻断 PD-1/PD-L1 抑制通路的免疫检查点抑制剂 (ICI) 已被临床证明可以恢复 T 细胞的功能活性，从而介导抗肿瘤免疫。FDA 批准的抗 PD-1 或 PD-L1 mAb（例如，派姆单抗、纳武单抗和阿特珠单抗）已在肾细胞癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌中表现出令人满意的临床疗效，但针对胶质瘤的临床研究仍在进行中。 Nivolumab 在复发及初诊胶质母细胞瘤患者的 II 期和 III 期研究中并未显示出明显的获益，这可能与胶质瘤中 PD-1 表达的改变以及 BBB 的限制作用有关。不同 ICI 联合治疗可提高疗效，但同时增加免疫相关不良事件的发生率。针对此问题，建立了 I 期临床试验，研究低剂量 ipilimumab 和 nivolumab 在肿瘤切除腔内脑内给药的疗效和安全性，临床结果显示该策略耐受性良好，且与令人鼓舞的总生存期和较低的免疫相关不良事件发生率相关。pembrolizumab 的给药可上调 IFN-γ 和 T 细胞相关基因表达，增强局部和系统的抗肿瘤免疫反应，并提高复发性胶质母细胞瘤患者的生存获益。另一项 I 期试验也证明，pembrolizumab 单药治疗具有持久的抗肿瘤活性，这表明，pembrolizumab 可能代表临床上治疗胶质瘤患者的有效治疗方式。

研究人员一直致力于探索新的免疫治疗靶点，以有效治疗胶质瘤患者。在胶质瘤环境中发现了一些有希望的候选靶点，例如吲哚胺2,3-双加氧酶 (IDO) 1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白受体-3和半乳糖凝集素-9。免疫检查点抑制剂 (ICI) 治疗的一个重要考虑因素是胶质瘤的结构和免疫学特性。纳米免疫疗法通过规避进入脑部的限制并增强免疫检查点抑制剂 (ICI) 的疗效，作为一种新的治疗方式，具有巨大的潜力，这将在第4部分讨论 。

3.3 逆转免疫抑制的免疫刺激剂

除了阻断肿瘤微环境中的抑制分子外，激活免疫细胞表面的共刺激受体，如可诱导 T 细胞共刺激分子、CD28 家族和 TNF 受体超家族，可增强针对异常癌细胞的效应免疫反应。一些信号通路在激活不同亚型的先天免疫细胞和启动适应性抗肿瘤免疫反应中起着至关重要的作用，例如 IL-2 受体、Toll 样受体 (TLR)、核因子 κB 和环鸟苷酸环化酶-腺苷酸合酶 (cGAS)/干扰素基因刺激因子 (STING) 通路。针对这些通路的激动剂抗体或小分子激动剂是逆转肿瘤免疫抑制的新兴方法，一些先进的候选药物正在进入胶质瘤免疫治疗的临床试验。

模式识别受体家族，例如 TLR，可以感知和识别与病原体相关的分子模式。胞嘧啶-磷酸二酯-鸟嘌呤 (CpG) 寡核苷酸是 TLR9 感知的强效激动剂，可在癌症治疗中激活治疗。TLR9 的刺激可促进树突状细胞和 B 细胞的活化，从而诱导针对癌细胞的强效 Th1 免疫应答。一项 II 期临床研究评估了胶质母细胞瘤患者肿瘤切除后局部使用 CpG 的安全性和治疗效果，该研究并未延长患者的生存期，尽管这种免疫疗法耐受性良好。相比之下，一项名为 veledimex（腺病毒编码的 IL-12）的产品的 I 期临床研究 (NCT02026271) 表明，在高级别胶质瘤患者中安全性可接受，且总体生存率令人鼓舞。I 期临床试验 (NCT03636477) 评估了 Veledimex 和 nivolumab 的联合治疗，结果显示联合治疗耐受性良好，并可增加肿瘤 IFN- γ。这些令人鼓舞的临床结果促使在 II 期临床试验 (NCT04006119) 中进一步评估 Veledimex 和 ICIs 的联合治疗。

cGAS是一种双链DNA传感器，可催化环磷酸鸟苷-磷酸腺苷（cGAMP）的生成。cGAS/STING复合物的形成可激活内质网表达的STING，从而产生I型干扰素（IFN- α / β）。STING激动剂在临床前研究中被看作是增强抗肿瘤免疫力的有前景的免疫治疗方式，未来有可能进入临床研究阶段。

3.4 过继细胞疗法

过继细胞疗法 (ACT) 是一种免疫疗法，利用患者自体 T 淋巴细胞清除癌细胞。TIL 是首个也是研究最多的 ACT，其从患者肿瘤活检中提取具有抗肿瘤活性的 TIL，然后在 IL-2 介导下增殖扩增，并回输回患者体内。早在 20 世纪 80 年代，自体 TIL 就显示出能够使患者体内的转移性黑色素瘤消退的能力。一项基于 TIL 的免疫疗法 II 期研究 (NCT01585428) 表明，该疗法对转移性宫颈癌患者具有显著的治疗效果（完全消退）。目前，使用 TIL 的免疫疗法在多种肿瘤中均显示出临床疗效，但在神经胶质瘤中尚无疗效。

为了扩大 ACT 免疫疗法的实施范围，人们开发了带有抗原特异性受体（包括 CAR 和 TCR）的基因工程 T 细胞，以提高对肿瘤细胞的识别和消除。TCR-T 细胞识别肿瘤抗原肽和 MHC 分子的复合物以杀死肿瘤。2022 年初，FDA 批准了 TCR 治疗药物 Kimmtrak，该药物含有针对肿瘤抗原 gp100 的 TCR 和 CD3 特异性单链可变片段，用于治疗黑色素瘤。最近，一种 TCR 治疗药物在 MHC 人源化神经胶质瘤模型中显示出良好的效果，这可能为临床试验铺平道路。与 TCR-T 细胞不同，CAR-T 细胞介导不依赖于 MHC 分子的抗原靶向过程，并融合共刺激结构域以增强颗粒酶和细胞因子的释放。FDA已批准数种CAR-T细胞疗法用于治疗血液系统恶性肿瘤，并取得疗效。目前，CAR-T细胞疗法在包括胶质瘤在内的实体瘤中疗效有限。早期临床结果证实了CAR-T疗法在胶质母细胞瘤患者中的可行性、安全性及一定的有效性。最近，经二唾液酸神经节苷脂结合结构域修饰的CAR-T细胞在四分之三的胶质瘤患者中表现出临床安全性和获益。然而，由于受试者人数较少，需要对大量患者进行进一步的临床研究以确定治疗效果。

3.5 溶瘤病毒疗法

尽管 ICI 在临床上取得了显著成功，但仍有少数患者对 ICI 有反应，应答率为 10% 至 30%。溶瘤病毒疗法是一种有望增强患者对 ICI 应答的策略。在溶瘤病毒疗法中，经过基因改造的低毒性病毒可以通过多种机制增强针对癌症的免疫反应，例如裂解肿瘤细胞以释放免疫遗传性抗原，以及改变肿瘤相关内皮细胞 (EC)，通过抗病毒机制介导的 I 型干扰素 (IFN) 刺激肿瘤微环境。2015 年，源自人类单纯疱疹病毒 1 型 (HSV-1) 并通过 GM-CSF 细胞因子进行基因改造的溶瘤病毒药物成为 FDA 批准的首个也是唯一一个用于治疗黑色素瘤患者的药物。这些令人鼓舞的结果促进了 HSV 在治疗其他肿瘤方面的临床应用。例如，G207 和 HSV-1716（HSV-1 变体）在 I 期和 II 期研究中被批准可安全用于胶质母细胞瘤患者。最近，一项 I 期临床试验 (NCT02457845) 表明，在儿童高级别胶质瘤患者中，单独使用肿瘤内 G207 或与放射治疗联合使用可逆转肿瘤免疫抑制环境，且不良事件特征可接受。G47Δ (Delytact/Teserpaturev) 是通过消耗 G207 中的 a47 基因构建的，可增强癌细胞的溶瘤活性和免疫原性。G47Δ 在恶性复发性胶质母细胞瘤患者中开展的 I 期临床试验表明，13 名患者中有 12 名存活超过 1 年，这促使日本厚生劳动省于 2021 年批准溶瘤疗法用于治疗胶质瘤。这一显著成功代表了胶质瘤免疫疗法的一个里程碑（UMIN000002661 和 UMIN000015995）。除 HSV-1 外，使用其他类型病毒的溶瘤疗法也证实了胶质瘤治疗具有良好且安全的临床效果。DNX -2401 是一种选择性在肿瘤中复制的溶瘤腺病毒。最新的临床试验（ NCT03178032）结果表明，肿瘤内注射 DNX-2401 联合放射疗法可增强 T 细胞的效应功能，从而使 DIPG 患者的肿瘤缩小。

溶瘤病毒疗法是治疗恶性胶质瘤的一种新兴选择。溶瘤病毒优先在肿瘤内复制，重塑肿瘤微环境，从而引发强效的抗肿瘤免疫反应。大多数溶瘤病毒通过立体定向注射给药，但有些病毒在血脑屏障（BBB）穿透方面表现良好。潜在的全身毒性被认为是最重要的考虑因素之一。

表1 列出了目前正在进行胶质瘤治疗临床研究的新发现的免疫靶点。

表1. 正在进行的胶质瘤新型靶向免疫治疗临床试验

4 新兴纳米技术增强胶质瘤免疫疗法

先前推出的免疫治疗策略在胶质瘤患者中往往疗效不佳，且副作用不明显。纳米技术平台的最新进展使得能够封装、保护和调节免疫治疗药物的作用，从而克服血脑屏障（BBB）和胶质瘤对免疫治疗产生耐药性的物理障碍。精确调节纳米平台的物理化学特性，可以靶向特定组织、细胞亚群和细胞内区域，避免与施用游离免疫药物相关的系统性毒性。

4.1 用于治疗胶质瘤的纳米佐剂疫苗

尽管癌症治疗疫苗取得了巨大进展，但将疫苗选择性递送至淋巴器官并启动深度抗肿瘤免疫力仍然是一项紧迫的挑战。例如，Hailemichael 等人用不完全弗氏佐剂 (IFA) 递送的黑色素瘤新抗原肽 (gp100) 对小鼠进行免疫，IFA 常用于临床研究中的癌症疫苗。结果表明，IFA 的水包油乳剂在皮肤形成储存库，因此大多数肿瘤抗原特异性 T 细胞在疫苗注射部位处于功能障碍状态，导致肿瘤清除效果不佳。为了避免疫苗沉积介导的 T 细胞在免疫部位持续积聚和凋亡，作者尝试在没有 IFA 的情况下用水性肽疫苗为小鼠接种，但未能在 dLN 中引发 T 细胞。皮下注射游离小分子肽疫苗可能导致其快速扩散至外周血管或在无佐剂的情况下产生免疫耐受。因此，研究人员致力于开发能够将新抗原肽和佐剂共同转运至 dLN 的疫苗递送系统。由于尺寸小，纳米材料可通过被动穿透 EC 层实现有效引流至 dLN。例如，与天然脂蛋白特性非常相似的合成高密度脂蛋白 (sHDL) 纳米盘是疫苗递送的有希望的代表性候选材料。Kuai 等人报道，sHDL（直径约 10.5 纳米）能够在皮肤 dLN 中共同递送肿瘤抗原肽和小分子佐剂 CpG，从而显著增强针对小鼠结肠癌和黑色素瘤的 CD8 + T 应答。最近，该研究小组证明了 sHDL 在递送治疗性肽疫苗用于治疗神经胶质瘤方面的潜力。sHDL 由 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和 22 个氨基酸的 ApoA1 模拟肽构成，其中吡啶基二硫化物修饰的磷脂与 sHDL 结合，以还原敏感的方式释放筛选出的肿瘤新抗原（AALLNKYLA、MSLQFMTL 和 GAIFNGFTL），这些肿瘤新抗原与胆固醇修饰的 CpG1826 共价连接。在一项治疗方案中，使用工程化纳米疫苗免疫的GL261胶质瘤小鼠表现出血液中新抗原特异性T细胞的显著诱导，并且已形成的肿瘤显著消退，尤其是在联合使用抗PD-L1抗体时。肿瘤微环境分析显示肿瘤浸润CD8 + T细胞和M1样巨噬细胞显著增加，这解释了疫苗介导的强效抗肿瘤免疫力。当小鼠对侧大脑再次接受GL261胶质瘤细胞攻击时，其仍然没有肿瘤，表明成功建立了持久的记忆性免疫反应。纳米材料为设计出令人瞩目的胶质瘤治疗性疫苗提供了一个强大的递送平台。

或者，肿瘤来源的外泌体（30-100 纳米囊泡，含有供体肿瘤相关蛋白质和核酸）被证明能够比树突状细胞疫苗中的肿瘤裂解物更好地启动 CTL。例如，刘等人将 C6 胶质瘤细胞来源的外泌体和α-半乳糖神经酰胺（一种激活恒定自然杀伤 T 细胞的佐剂）装载到树突状细胞中。与用肿瘤裂解物脉冲的树突状细胞疫苗相比，开发的树突状细胞疫苗诱导了增强的肿瘤特异性 CTL，降低了免疫抑制细胞因子，并显著提高了小鼠的存活率。此外，外泌体易于储存和提取，因此是未来临床转化的合适且有潜力的树突状细胞疫苗平台。

4.2 纳米技术介导的免疫检查点抑制剂 (ICI) 用于胶质瘤治疗

与治疗性疫苗一样，ICI 已广泛应用于通过恢复 T 细胞细胞毒功能治疗神经胶质瘤的临床试验中，例如针对 CTLA-4、IDO 和 PD-1/PD-L1 抑制受体的 mAb。尽管如此，神经胶质瘤患者通常对 ICI 免疫疗法有抗药性。其中一个关键原因是 BBB 的存在限制了免疫治疗 mAb 渗透到神经胶质瘤部位，因此人们探索了多种策略来提高脑内递送效率。一种主要方法是将药物与配体结合，这些配体与 EC 或神经胶质瘤细胞上表达的受体结合，引发受体介导的胞吞作用穿过 BBB。例如，乙酰胆碱和胆碱类似物可以与 EC 和神经胶质瘤细胞上过量分布的胆碱转运蛋白相互作用。最近，Wang 等人利用 3-(溴甲基)-4-甲基-2,5-呋喃二酮 (MMfu) 作为 pH 敏感连接体，生成了一种聚合物纳米胶囊，用于将抗 PD-L1 mAb 递送至神经胶质瘤（图4a）。设计的纳米胶囊直径约为 45 纳米（图4b）。胆碱类似物促进 BBB 穿越（图4c），显著增加在神经胶质瘤部位的积累（图4d）。MMfu 能够在酸性微环境下触发神经胶质瘤部位特异性释放抗 PD-L1（图4c），减少封装的免疫药物在血液循环中的泄漏。纳米胶囊显著增强了抗 PD-L1 抗体对神经胶质瘤的免疫治疗效果（图4e）。

图4 构建的聚（2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱）-共-（3-（溴甲基）-4-甲基-2,5-呋喃二酮-聚（乙二醇）二丙烯酸酯（pMPC-co-[MMfu-pPEGMA]）聚合物含有胆碱类似物 MPC 和 pH 敏感的 MMfu，可促进 BBB 通透性和刺激释放包裹的抗程序性死亡配体 1（抗 PD-L1）抗体，以增强神经胶质瘤免疫治疗。a）抗 PD-L1 和聚合物偶联物的化学结构和合成过程示意图。b）聚合物和抗 PD-L1 单克隆抗体 (mAb) 偶联物的透射电子显微镜 (TEM) 图像。c) 抗 PD-L1 和聚合物偶联物介导的神经胶质瘤免疫治疗机制。d) 注射不同制剂后对小鼠脑内神经胶质瘤进行荧光成像。增强型绿色荧光蛋白和 Cy5.5 分别表示神经胶质瘤细胞和标记的 IgG 抗体。e）接受不同治疗的小鼠的无病生存曲线。

除了胆碱转运体介导的胞吞作用外，低密度脂蛋白受体和转铁蛋白受体 (TfR) 也是增强 BBB 渗透的替代介质。例如，Galstyan 等人用抗鼠 TfR 抗体功能化聚（β - l-苹果酸）纳米颗粒，这使得抗 PD-1 或抗 CTLA-4 mAb能够跨BBB 递送，用于神经胶质瘤免疫治疗。免疫纳米疗法有效调节神经胶质母细胞瘤环境，增加肿瘤浸润效应 CD8 + T 细胞和自然杀伤细胞，同时减少免疫抑制性 Treg。与接受游离抗 PD-1 或抗 CTLA-4 mAb 治疗的神经胶质母细胞瘤小鼠相比，接受纳米疗法治疗的神经胶质母细胞瘤小鼠的存活率更高。这些临床前研究表明，在促进 BBB 交叉的纳米平台中配制的 ICI 是一种可能克服神经胶质瘤对 ICI 免疫疗法的抵抗力的有效策略。

4.3 用于胶质瘤治疗的纳米刺激器

与其他恶性肿瘤相比，神经胶质瘤微环境中肿瘤浸润性 T 细胞的频率较低，但含有丰富的免疫抑制细胞，如 MDSC、TAM 和 Treg。为了逆转局部免疫抑制并促进效应 T 细胞的肿瘤浸润，作用于不同复杂信号通路的治疗性免疫刺激剂已在临床前动物模型和临床研究中进行了评估，以增强神经胶质瘤的免疫治疗。然而，这些刺激剂在给药后往往会引起全身炎症反应、快速血液清除以及无法有效输送至神经胶质瘤部位，从而严重阻碍了其临床进展。先进的纳米材料可以精确地将免疫刺激剂输送到目标部位，为安全有效的神经胶质瘤治疗带来巨大的潜力。

4.3.1 纳米刺激器靶向TLR信号通路

靶向TLR9的游离CpG分子因核酸内切酶的作用而在血清中不稳定，从而显著降低CpG的免疫效力。在神经胶质瘤中，研究发现CpG-TLR9通路的激活可增强肿瘤侵袭性并维持癌症干细胞。为了在保持免疫刺激能力的同时降低促肿瘤作用，将CpG分子与单壁碳纳米管（SWNT）非共价结合，这使得在小鼠模型中能够根除已形成的神经胶质瘤，并长期保持无肿瘤状态。从机制上讲，CpG/SWNT可增强单核细胞产生促炎细胞因子，从而增强抗肿瘤免疫力。

神经干细胞 (NSC) 可以运输到神经胶质瘤和其他肿瘤的缺氧区域，临床试验正在探索其用于递送抗肿瘤药物。因此，Adamus 等人将 CpG 与反义寡核苷酸偶联物装入 NSC，这些反义寡核苷酸靶向信号转导和转录激活因子 (STAT)3，而 STAT3 是癌症治疗耐药性的关键启动子。细胞摄取后，NSC 分泌出含有 CpG-STAT3 反义寡核苷酸偶联物的外泌体，这强烈激活了神经胶质瘤相关的小胶质细胞，并对原位 GL261 肿瘤显示出强大的治疗效果。最近，Wei 等人。工程化的载脂蛋白E (ApoE) 肽功能化聚合物囊泡可共同递送CpG和颗粒酶B，其中ApoE促进血脑屏障（BBB）渗透至胶质瘤部位，颗粒酶B诱导细胞间充质细胞损伤（ICD），CpG激活树突状细胞（DC）并引发肿瘤抗原特异性T细胞免疫。接受工程化的纳米免疫疗法治疗的胶质瘤小鼠明显延缓了肿瘤进展。

除了递送功能外，一些纳米颗粒还是激活TLR的天然刺激物，例如病毒样颗粒（VLP，20-500纳米），它们在没有病毒核酸的情况下呈现出由病毒衣壳蛋白组成的三维结构。Kerstetter-Fogle等人研究了豇豆花叶病毒植物VLP用于神经胶质瘤免疫治疗的效力。[ 147 ]植物VLP脑内注射后，肿瘤浸润性中性粒细胞、自然杀伤细胞和适应性免疫细胞在小鼠神经胶质瘤部位被大量募集，导致肿瘤显著消退。靶向TLR信号通路的纳米免疫治疗药物为增强神经胶质瘤免疫治疗的效力提供了一种有效且安全的策略。

4.3.2 纳米刺激器靶向STING信号通路

作为 cGAMP 类似物，SR-717 是一种非核苷酸 STING 激动剂，具有抗肿瘤活性。为探索 SR-717 在神经胶质瘤治疗中的潜力，Wang 等人通过基因工程改造人类重链铁蛋白 (HFn) 和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGE) 融合蛋白，使其能够自组装成纳米颗粒，将 SR-717 递送至脑肿瘤（图5a）。 HFn 可以与 BBB 内皮细胞上过表达的 TfR1 结合，从而通过受体介导的胞吞转运有效穿过 BBB。RGE 是一种肿瘤靶向肽，可使封装的 SR-717 具有极好的神经胶质瘤归巢能力（图5a）。静脉注射设计的纳米颗粒后，这种双靶向纳米颗粒增加了 SR717 在肿瘤中的积累，促进 GL261 肿瘤缓解，并延长小鼠生存期（图5b）。从机制上讲，工程纳米颗粒增强了 STING 的活化（图5c）和效应 CD8 + T 细胞在肿瘤中的浸润（图5d）。环二鸟苷酸单磷酸 (cdGMP) 是另一种 STING 激动剂，它可以通过促进促炎 I 型 IFN 的分泌来激活 APC。为了减少 cdGMP 的脱靶相关副作用，Bielecki 等人将 cdGMP 负载到无机介孔二氧化硅纳米颗粒（60 nm）中。介孔二氧化硅纳米粒子中丰富的可质子化胺基使环磷酸鸟苷（cdGMP）能够从内体逸出，随后在细胞质中激活STING，从而促进抗原呈递细胞（APC）的活化和针对胶质瘤的适应性免疫。与其他类型的癌症相比，在纳米平台中形成的STING激动剂在胶质瘤治疗中的免疫治疗效力研究较少。

图5 基因工程改造的人类重链铁蛋白纳米粒子（HFn NPs）修饰RGE，并包裹干扰素基因刺激剂（STING）激动剂SR717，可有效治疗神经胶质瘤。a）SR717@RGE-HFn NPs的制备流程及免疫治疗机制示意图。b）颅内接种GL261细胞并接受不同治疗的小鼠的实验时间线、平均肿瘤重量和生存曲线。c）通过蛋白质印迹分析测量p -STING、p -TBK1和p -IRF3的表达。d）治疗后神经胶质瘤组织中浸润的CD8 + T细胞百分比。

4.3.3 纳米刺激器——靶向与TAM相关的其他信号通路

除了 TLR 和 STING 刺激剂外，还构建了替代策略以靶向特异性免疫抑制因子或信号通路，从而减少或重新编程神经胶质瘤中的免疫抑制细胞。小胶质细胞和巨噬细胞是神经胶质瘤的主要免疫抑制成分（占神经胶质瘤质量的 30%）。大多数 TAM 从抗肿瘤 M1 型极化为促肿瘤 M2 型，导致癌细胞快速增殖。因此，人们探索了各种小分子以针对调节 TAM 极化的一些关键因素进行神经胶质瘤免疫治疗。]例如，植物来源的绿原酸 (CHA) 能够通过激活 STAT1 信号通路同时抑制 STAT6 通路来逆转 TAM 的极化。I 期临床研究表明，CHA 是一种安全且有前景的癌症治疗分子。然而，其在体内清除迅速，需要反复肌肉注射才能维持治疗效果，导致患者依从性差。为了解决这些问题，Ye 等人将 CHA 封装在甘露糖化脂质体中，用于治疗神经胶质瘤（图6a）。甘露糖化脂质体本身能够靶向表达在 TAM 表面的甘露糖受体（也称为 CD206），并将肿瘤从 M2 表型转变为 M1 表型（图6a）。甘露糖化聚乙二醇(PEG) 脂质体显著促进其在肿瘤部位的积聚（图6b），从而有效抑制神经胶质瘤生长（图6c）。PEG 脂质体的“储存效应”促进了记忆 T 细胞的浸润，从而介导对神经胶质瘤细胞的长期免疫治疗作用。

图6 纳米制剂疗法将M2表型小胶质细胞和巨噬细胞的极化逆转为针对神经胶质瘤的M1样表型。a）用CHA（Man-PEG-Lipo）包裹的甘露糖化PEG脂质体的结构示意图及其针对神经胶质瘤的治疗机制。b）静脉注射后不同制剂在不同器官中的体内生物分布。c）显示所示各种治疗后肿瘤大小的照片。d）用于神经胶质瘤免疫治疗的含有miR155的Vir-Gel制剂的制备工艺和作用方式。e）接受不同治疗的小鼠的累积生存曲线。f）神经胶质瘤组织中M2（CD206 hi）和M1（CD86 hi）小胶质细胞和巨噬细胞的流式细胞术分析。

基于核酸的疗法是编辑、抑制或替换调控TAM发育的转录因子的互补方法。为了在体内发挥作用，核酸通常需要递送平台来保护其免受核酸酶降解，并促进编码蛋白质分子的表达。例如，Stephan及其同事设计了修饰有二甘露糖靶向部分的聚（β-氨基酯）聚合物，用于递送体外转录的信使RNA (mRNA)。该mRNA编码干扰素调节因子5及其上游信号IKKβ（一种磷酸化激酶），这些转录因子可将TAM重编程为M1表型，用于治疗神经胶质瘤。该纳米mRNA平台在多种其他小鼠肿瘤模型（卵巢癌和黑色素瘤）中表现出治疗效力，并且在重复给药的情况下具有出色的安全性。除 mRNA 免疫疗法外，miRNA（例如 miR-155）是使 TAM 极化为 M1 表型的关键调控分子。因此，Zhang 等人设计了一种病毒样纳米凝胶来递送 miR-155，用于治疗神经胶质瘤（图6d）。miR-155 分子被封装在由 DNA 偶联聚合物交联的纳米凝胶中，然后用促进细胞渗透的红细胞膜包裹，并用靶向小胶质细胞和巨噬细胞的 M2pep 和 A2 肽进行修饰（表示为 Vir-Gel，图6d）。给药后，递送的 miRNA 下调了细胞因子信号传导的炎症抑制因子 1（SOCS1），从而促进了免疫原性细胞因子的产生。分泌的细胞因子反过来又使小胶质细胞和巨噬细胞重编程，使其向M1型巨噬细胞极化，对抗胶质瘤细胞。Vir-Gel疗法显著抑制了胶质瘤的生长，并延长了小鼠的生存期（图6e）。胶质瘤中M2型小胶质细胞和巨噬细胞的频率显著降低（图6f），这解释了抗肿瘤活性的增强。在另一项研究中，HEK293T细胞衍生的外泌体显示出高效递送靶向STAT3通路的miR-124的功效，促进TAM向M1型巨噬细胞极化，并抑制肿瘤进展。

C–X–C 基序趋化因子配体 (CXCL)12/C–X–C 基序趋化因子受体 (CXCR)4 轴已被证明是募集免疫抑制性 TAM 的另一个重要因素，从而加剧了胶质瘤手术切除后复发的免疫抑制。为了逆转胶质瘤的局部免疫抑制，Zhang 等人设计了一种水凝胶，用于术后共同递送与金属 Zn(II) 和 CpG/聚-l-赖氨酸纳米颗粒螯合的 CXCL12/CXCR4 轴抑制剂 (AMD3100)。该范例有效地阻止了小胶质细胞和巨噬细胞的肿瘤募集，并激活了效应 T 细胞，显示出针对胶质瘤的强大免疫治疗作用。

将免疫治疗分子纳米颗粒化是提高抗胶质瘤疗效的一种有前景的策略。鉴于纳米颗粒的物理化学特性（例如表面电荷和尺寸）是决定其器官选择性的因素，探索其活性-结构相关性将促进用于治疗胶质瘤的纳米免疫疗法的发展。

4.4 纳米技术介导的胶质瘤联合治疗

癌症患者通常可从联合治疗中获益，例如免疫疗法与化疗、放疗或手术的联合治疗。免疫治疗与其他诱导免疫原性因子、促进针对肿瘤的免疫反应的治疗方法相结合，可以增强免疫治疗效果，从而为癌症患者带来生存获益。在临床前和临床研究中，联合治疗方案已被广泛探索，以期有效治疗胶质瘤。

4.4.1 免疫疗法与针对胶质瘤细胞的疗法相结合

尽管癌症免疫治疗前景光明，但临床试验结果表明，单一免疫疗法对抗癌细胞仍不是最佳选择。例如，免疫检查点抑制剂（ICI）已成为肿瘤免疫治疗的前沿，但临床反应率相对较低（约为 10-25%）。与此同时，针对神经胶质瘤生长途径的纳米治疗药物，如索拉非尼激酶抑制剂和 volasertib，在临床前研究中展现出巨大潜力。 联合治疗方式可能会改变免疫抑制环境，从而增强肿瘤对 ICI 的敏感性，例如针对抑制基因 p53 的治疗药物，该基因通常在人类癌症中缺失，并与肿瘤生长有关。纳米治疗剂SGT-53含有一个阳离子脂质体，该脂质体上修饰有一个可变的单链片段，可识别肿瘤细胞上过表达的转铁蛋白受体，以及一个编码人野生型p53的质粒。SGT-53的临床研究表明，它可以在肿瘤患者中恢复p53表达介导的治疗活性。Kim等人首次评估了SGT -53与抗PD-1单克隆抗体联合治疗神经胶质瘤的疗效。结果显示，SGT-53能提高凋亡神经胶质瘤细胞的免疫原性，从而促进T细胞对神经胶质瘤的浸润。SGT-53与抗PD-1单克隆抗体联合治疗可显著抑制肿瘤生长，而单独使用抗PD-1单克隆抗体治疗效果有限。

烟酰胺磷酸核糖基转移酶是一种能够将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的酶，它能够维持细胞能量并为癌细胞增殖提供必需的底物。因此，烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂是治疗神经胶质瘤的一种有吸引力的策略，而这些抑制剂分子往往会对正常细胞产生不良反应，例如 GMX1778。为了降低 GMX1778 的系统毒性，Li 等人将 GMX1778 封装到聚合物颗粒中。肿瘤内注射负载 GMX1778 的纳米颗粒可上调神经胶质瘤细胞 PD-L1 的表达。GMX1778 与抗 PD-1 mAb 的联合治疗显著增强了效应 T 细胞的募集，并减少了促肿瘤 M2 型巨噬细胞的浸润，从而增强了对神经胶质瘤的治疗效果。

与 PD-1/PD-L1 对效应 T 细胞的抑制作用不同，癌细胞上表达的 CD47 可以通过配体-受体相互作用与巨噬细胞上的信号调节蛋白α (SIRP α) 结合，抑制巨噬细胞的吞噬能力。因此，已经探索了阻断 CD47-SIRP α抑制信号通路以恢复巨噬细胞吞噬介导的抗肿瘤功能的治疗策略。为了增强治疗效果，Liu 等人最近设计了可离子化的阳离子脂质纳米颗粒 (LNP)，它们具有优化的胺基头部基团，可递送小干扰 RNA (siRNA) 分子，从而沉默神经胶质瘤细胞上表达的 PD-L1 和 CD47 分子。优化的阳离子纳米复合物通过与阴离子细胞膜相互作用显示出有效的BBB穿透性，并将siRNA分子靶向递送至大脑，降低PD-L1和CD47蛋白的表达水平，从而增强胶质瘤癌的免疫治疗。

免疫细胞与结构细胞（例如癌细胞和基质细胞）之间的异质性相互作用，为胶质瘤的生长提供了免疫抑制环境。单一免疫疗法仅阻断一种抑制性受体通路，不足以有效清除癌细胞。已有证据表明，针对癌细胞或免疫细胞的联合治疗策略可以调节免疫抑制环境，从而对胶质瘤的治疗产生协同效应。

4.4.2 化疗联合免疫治疗

尽管治疗性胶质瘤疫苗能够有效激活肿瘤特异性T细胞，但如何募集大量效应免疫细胞浸润胶质瘤部位，使其免受免疫抑制因素的影响，仍然是一项挑战。纳米技术介导的化疗提供了一种靶向递送策略，可将化疗药物系统性地递送至胶质瘤，其中浸润肿瘤的树突状细胞 (DC) 可以从免疫原性垂死细胞中获取肿瘤抗原。随后，活化的树突状细胞 (DC) 迁移至肿瘤淋巴结 (dLN)，将抗原呈递给幼稚T细胞，从而激活肿瘤抗原特异性T细胞免疫。效应T细胞将前往肿瘤部位，产生细胞因子来杀死胶质瘤细胞并逆转免疫抑制环境。因此，在纳米平台上联合使用化疗和免疫疗法是胶质瘤治疗的一种普遍方案。

在化疗药物中，TMZ 是治疗神经胶质瘤的首选烷化剂。TMZ 给药通过烷基化基因组 DNA 引起核苷酸错配和细胞周期停滞，从而导致肿瘤细胞。TMZ 良好的亲脂性使其能够穿透 BBB 治疗神经胶质瘤，而 TMZ 耐药性通常通过多种机制发生，例如 DNA 修复途径、存活自噬和神经胶质瘤干细胞增殖。OTX015（缩写为 OTX）是含溴结构域蛋白 4 的抑制剂，它可以通过降低 DNA 损伤修复反应来增强肿瘤细胞对 TMZ 的反应。然而，OTX 在 BBB 穿透性和神经胶质瘤靶向性方面表现不佳。为了实现 OTX 和 TMZ 向神经胶质瘤的靶向共递送，我们通过超声处理的方法将 TMZ 和 OTX 封装在核心内，从而设计了红细胞膜包被的缩醛-葡聚糖纳米粒（图7a）。设计的纳米粒直径约为 150 纳米（图7b），其中嵌入的缩醛-葡聚糖通过裂解缩醛基团实现在酸性肿瘤环境下 pH 响应性药物释放，用 ApoE 修饰的红细胞膜通过靶向 LPR 促进药物穿过 BBB。TMZ 和 OTX 联合促进神经胶质瘤细胞的 ICD（图7c）、DC 激活（图7d）和 T 细胞启动，增加了肿瘤部位 CTL 的浸润。此外，OTX 有效抑制了神经胶质瘤细胞 PD-L1 的表达。 ICD效应和PD-L1抑制相结合有效地逆转了免疫抑制微环境，从而显著抑制了神经胶质瘤的生长（图7e）。

图7 混合生物膜纳米悬浮液共同递送化疗和免疫治疗剂，用于神经胶质瘤的协同联合治疗。a）ApoE修饰的仿生纳米药物（ABNM）@替莫唑胺（TMZ）/OTX015（ABNM@TMZ/OTX）的配方示意图。b）ABNM@TMZ/OTX的负染色TEM图像。c）化学药物TME与PD-L1抑制剂OTX联合治疗的治疗机制示意图。d）流式细胞术分析神经胶质瘤-dLNs来源的DC成熟情况；e）小鼠在接受各种治疗后神经胶质瘤个体生长曲线。f）多西他赛（DTX）纳米悬浮液（DNS）–[C6&DC]m）的制备过程示意图。g）用不同纳米治疗剂治疗的小鼠的生存曲线。 （1 磷酸盐缓冲液；2 DTX；3 DNS；4 DNS–树突状细胞膜 (DCm)；5 DNS–C6 胶质瘤细胞膜；6 DNS-[C6&DC]m）。

TGF- β抑制T细胞和B细胞增殖，使肿瘤细胞逃避免疫，这也降低了TMZ的敏感性。因此，Qiao等人设计了双靶向纳米诊疗系统（血管肽-2修饰的磷酸乙醇胺多羧基甜菜碱[DSPE-PCB]）来递送针对TGF- β的siRNA ，提高神经胶质瘤细胞对共同递送的TMZ的敏感性。两性离子脂质DSPE-PCB有助于溶酶体逃逸，这对于siRNA分子的胞浆递送和随后的沉默功能至关重要。修饰在纳米粒子表面的活性氧（ROS）响应性聚合物能够在肿瘤部位控制释放治疗药物，而封装的氧化铁纳米粒子则可以进行磁共振成像跟踪。成像引导的纳米平台对神经胶质瘤显示出强大的治疗效果。

与烷化剂不同，紫杉烷类药物，例如紫杉醇 (PTX)、多西他赛 (DTX) 和卡巴他赛，通过稳定微管和抑制癌细胞有丝分裂来抵抗肿瘤增殖。为检验 PTX 诱导的 ICD 在增强神经胶质瘤对 ICI 反应方面的功效，Sun 等人将载有 PTX 的 PEG–聚（ε-己内酯）共聚物与 PD-L1 mAb 连接，结果显示显著增强了神经胶质瘤治疗效果。纳米胶束共递送 PTX 和咪喹莫特（一种用于 TAM 极化的 TLR7 激动剂），显示出对神经胶质瘤的协同治疗作用。为增强联合治疗效果，Wang 等人将 PTX 与咪喹莫特一起用于治疗神经胶质瘤。构建了一种三维网络水凝胶（PLGA 1750 -PEG 1500 -凝胶1750），用于术后腔内给药的原位缓释PTX-CpG纳米粒子。在该设计中，神经胶质瘤归巢肽（Pep-1）和APC靶向分子（甘露醇）被修饰在嵌入水凝胶中的PTX和CpG纳米粒子上，并响应体温。化疗和免疫纳米治疗药物的缓释能够使术后残留的神经胶质瘤消退，并成功防止神经胶质瘤复发。

细胞膜包覆的纳米粒子代表了一个颇具吸引力的平台，它可帮助封装的治疗剂克服生物屏障，从而有效对抗癌细胞。Hao 等人利用细胞膜包覆高负载容量的疏水性化学药物纳米混悬液，用于治疗神经胶质瘤。具体而言，作者融合了来自神经胶质瘤 C6 细胞和树突状细胞的细胞膜（图7f）。神经胶质瘤细胞膜提供多种靶向神经胶质瘤的抗原和结构域，而树突状细胞膜可在抗原刺激下激活 T 细胞。与传统树突状细胞疫苗相比，通过超声波沉淀法制备的 C6 和树突状细胞混合膜（[C6&DC]m）显示出增强的生物安全性和 DTX 纳米混悬液（DNS）的储存性。在 C6 细胞膜介导的同型靶向驱动下，构建的 DNS-[C6 & DC]m 在神经胶质瘤中的蓄积显著增加。树突状细胞膜与肿瘤抗原协同作用，促进抗原呈递，激活T细胞。多功能仿生纳米粒子表现出化疗和免疫疗法的联合作用，从而延长了胶质瘤小鼠的生存期（图7g）。细胞膜包覆的纳米平台有望在胶质瘤治疗中发挥化疗和免疫疗法联合治疗的潜力。

一些抗癌化学药物源自波塞链霉菌（Streptomyces peucetius）的突变菌株，即蒽环类药物，例如柔红霉素、阿霉素 (DOX) 和米托蒽醌。从机制上讲，这些药物与碱性基团结合，抑制 DNA 复制和 RNA 合成。此外，这类抗癌药物还能阻断拓扑异构酶 II，从而抑制癌细胞增殖。此外，还涉及其他一些分子机制，例如氧自由基的产生和线粒体功能障碍。然而，对正常组织（尤其是心肌组织）的副作用是这些强效抗癌药物的主要顾虑。

DOX 是一种水溶性化学药物，于 1974 年获得 FDA 批准，是广谱肿瘤的一线抗癌药物。为避免全身毒性，DOX 分子被配制在 LNP 中，名为 Doxil，自 1995 年以来已被证实可用于人体临床。临床前实验表明，DOX 纳米制剂是损伤相关分子模式的强效诱导剂，这可能会调节胶质瘤浸润的免疫细胞。为了提高树突状细胞疫苗的效力，Chen 等人利用树突状细胞 ( DC ) 来递送由聚甘油纳米金刚石和 DOX 分子形成的纳米 DOX。结果表明，树突状细胞成功地将 DOX 释放到胶质瘤细胞中，促进了损伤相关分子模式和肿瘤抗原的产生，并随后激活了针对胶质瘤的 T 细胞。

米托蒽醌是另一种不含氨基糖结构的蒽环类药物，因此不会产生对心脏有毒的自由基。为了防止胶质母细胞瘤复发，Zhang 等人构建了锌 2-甲基咪唑 (ZIF-8)，用于共递送米托蒽醌和免疫调节剂，以在颅内注射后引发杀瘤免疫。ZIF-8 的金属有机框架能够高效地负载米托蒽醌并在肿瘤微环境中进行酸性降解。封装的靶向 IDO1 的 siRNA 将逆转 IDO1 介导的免疫抑制。神经胶质瘤相关巨噬细胞膜用于伪装纳米颗粒（称为肿瘤归巢免疫纳米调节剂 (THINR)），从而实现神经胶质瘤归巢能力。 THINR 和 CXCL10 被封装于寡肽水凝胶（称为 THIN-CXCL10@Gel）中，以实现缓释。肿瘤内注射后，该多功能纳米系统可将胶质瘤免疫抑制微环境由“冷”转为“热”，抑制胶质瘤生长，产生对活化树突状细胞 (DC) 和启动 T 细胞的免疫抑制 (ICD)，并抑制 IDO1-Tregs 介导的免疫抑制。THINR-CXCL10@Gel 显著改善了胶质瘤中 CTL 的浸润，并阻止了肿瘤复发。

双硫仑最初于 1951 年被批准用于通过抑制乙醛脱氢酶来治疗酒精中毒， 1977 年发现其具有抗癌功效，尤其是与铜结合使用时。双硫仑和铜通过多种机制对癌症治疗具有协同作用，包括上调 ROS、促进肿瘤细胞凋亡和触发 ICD 介导的抗肿瘤免疫。在调节抑制性免疫环境方面，和厚朴酚被认为是一种强大的免疫调节剂，它通过阻断雷帕霉素信号通路介导的哺乳动物靶点免疫抑制来调节肿瘤细胞的糖酵解和自噬以及 TAM 向 M1 型极化。为了实现用于治疗胶质瘤的联合抗癌药物，Zheng 等人构建了一种脂质体系统，该系统包裹双硫仑/铜和和厚朴酚，并用D CDX肽（GREIRTGRAERWSEKF）修饰，靶向在胶质瘤细胞、内皮细胞和肿瘤相关细胞（TAM）上过表达的α7烟碱乙酰胆碱受体。这种采用“一石三鸟”策略的联合疗法通过重塑胶质瘤代谢和抑制性免疫环境，显示出良好的抗胶质母细胞瘤特性。通过神经递质修饰的脂质体递送喜树碱和姜黄素的联合治疗，已被证明是一种缓解免疫抑制环境的替代方法。细胞穿透肽 TAT (CYGRKKRRQRRR) 修饰的乳铁蛋白包裹辛伐他汀和芬维A胺，可激活 STAT6 通路介导的 TAM 复极化和 ROS 诱导的神经胶质瘤细胞线粒体凋亡。

最新进展的纳米技术能够将化疗药物富集于胶质瘤细胞内，这对于改善免疫疗法具有重要意义，因为它能够增强濒死癌细胞的免疫原性，启动效应T细胞免疫，并逆转肿瘤抑制。正如先前在临床前研究中讨论过的，这些引人入胜的纳米平台提供了令人鼓舞的结果，并有力地激励我们评估这些拟议的胶质瘤治疗方案。进一步探索这些治疗方式的安全性和有效性，将有助于推进其在临床研究中的应用。

4.4.3 放射治疗联合免疫治疗

放射治疗可以通过高能粒子或波（包括X射线、 γ射线、电子和质子）直接破坏癌细胞。近年来，越来越多的实验证据证明，放射治疗可以促进纳米治疗药物穿透血脑屏障，从而增强胶质瘤的治疗效果。此外，放射治疗还能引发广泛的DNA损伤，导致双链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA的释放，从而引发免疫原性癌细胞死亡，从而增强免疫系统对抗癌细胞的能力。放射治疗的固有特性为放射治疗和免疫治疗的结合奠定了基础。

放射治疗主要通过破坏DNA链以及与水分子反应产生自由基来杀死细胞，尤其对于高增殖率的肿瘤细胞更是如此。为了避免对正常细胞的不可避免的损害，人们研究了放射增敏剂，以靶向肿瘤部位并增加癌细胞对放射治疗的敏感性。[例如，金纳米粒子(AuNPs)可以通过光电效应和康普顿散射显著增加辐射剂量，从而促进ROS的产生，从而增强放射治疗效果。由于金纳米粒子易于制备、分布和释放迅速的特点，它是放射治疗中的主要放射增敏剂。为了探索放疗和免疫治疗在胶质瘤治疗中的联合疗效，陈等人用免疫原性细菌外膜囊泡(OMV)包裹金纳米粒子放射增敏剂。源自革兰氏阴性细菌的OMV是纳米级脂质双层囊泡，含有丰富的外膜蛋白，并以IFN- γ依赖的方式参与抗肿瘤反应。结合2戈瑞(Gy)放射治疗，稳定的共悬浮溶液（Au-OMV）在肿瘤内注射后对神经胶质瘤细胞表现出有效的杀伤作用，这是由于ROS和TNF- α的产生所致。在神经胶质瘤治疗中，CpG和Au-NPs增强放射治疗相结合也观察到了增强的治疗效果。Wei等人证明设计了ApoE修饰的嵌合可生物降解聚碳酸酯囊泡，可将CpG分子穿透BBB递送至神经胶质瘤部位。纳米CpG对胶质瘤的免疫治疗效果有限，而放射治疗则显著增强了免疫治疗效果。Kadiyala等人报道了利用sHDL纳米平台联合三种治疗方式进行联合治疗，其中DTX和CpG被sHDL包裹。在肿瘤内注射DTX-sHDL-CpG并进行放射治疗后，胶质母细胞瘤小鼠的肿瘤完全消退，小鼠可长期生存，并有效预防肿瘤复发。

除了放射增敏剂外，硼中子俘获疗法还可以减少对正常组织的损伤。硼中子俘获疗法通过核俘获和裂变反应杀死癌细胞，这需要肿瘤细胞中足够的10 B 聚集和准直中子束以激发10 B ( n , α ) 7 Li 俘获反应。为了提高靶向性并将硼中子俘获疗法药物集中在神经胶质瘤处，Chen 等人利用 DOX 递送碳硼烷 (CB)（图8a），这使得药物能够通过核孔复合体穿透细胞核。DOX-CB 被封装在用 iRGD 归巢肽（由 9 个氨基酸组成的环肽）修饰的阳离子脂质体中，这使得纳米颗粒能够靶向神经胶质瘤血管内皮细胞上过表达的α v整合素，并促进纳米颗粒在神经胶质瘤中的蓄积。同时，含有单向导RNA序列的质粒可以敲除CD47（图8b、c），并与巨噬细胞上表达的SIRPα结合，增强巨噬细胞吞噬胶质瘤细胞的能力。在中子束照射下，与其他治疗方式相比，具有联合治疗效果的工程纳米粒子显示GL261胶质瘤小鼠的生存期显著延长（图8d）。

图8 一种基于阳离子脂质体的纳米粒子将靶向核的阿霉素-碳硼烷 (DOX-CB) 药物与靶向 CD47 的成簇规律散播短回文重复序列 (CRISPR)-Cas9 系统相结合，用于对抗胶质母细胞瘤。a) DOX-CB@lipo-pDNA 内化 RGD (iRGD) 的制备工艺和联合治疗机制示意图。b) 用于 CD47 基因编辑的 CRISPR-Cas9 系统构建图。c) 每次治疗后 GL261 细胞中 CD47 的表达水平。d) 植入 GL261 肿瘤并接受不同纳米治疗的小鼠的存活率。

在胶质瘤治疗中，穿透血脑屏障 (BBB) 对于发挥联合功能至关重要。幸运的是，放射治疗具有额外的优势，能够通过 TAM 介导的血管爆发促进纳米治疗药物向脑肿瘤的运输。例如，Erel-Akbaba 等人证明，放射线可促进基于纳米技术的 siRNA 穿透血脑屏障，从而增强胶质瘤免疫治疗（图9a, b）。具体来说，作者通过微乳液稀释法构建了固体脂质纳米粒（SLN）（图9a），其中阳离子脂质酯基季铵盐用于吸附siRNA分子，同时加入1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚乙二醇-二苯并环辛炔（DSPE-PEG（2000）-DBCO）以功能化SLN，从而通过点击化学嫁接iRGD胶质瘤穿透肽。这种工程化的单层SLN（称为iRGD-SLN）具有低分子流动性和高稳定性，能够实现递送货物的控制释放。体内成像显示，放射治疗显著促进了iRGD-SLN在脑肿瘤部位的积聚（图9c）。递送的siRNA对EGFR和PD-L1均有效，可用于胶质母细胞瘤的联合免疫治疗。 iRGD–SLN–siEGFR/PD-L1 与 5 Gy X 射线辐射相结合，显示脑胶质瘤显著消退（图9d）。类似的概念也在基于细胞外载体的纳米平台中得到验证。细胞外载体由内源性细胞分泌，具有低免疫原性和极好的稳定性。Tian等人从 ReNcell VM 细胞（一种神经祖细胞系）中收获了细胞外载体（图9e、f），并与胶质瘤靶向配体 c(RGDyK) 结合（表示为 RGD-细胞外载体 (EV)）。Cy5.5 的结合是为了评估 RGD-EV 的生物分布。体内成像结果表明，放射治疗显著增强了 RGD-EV 向脑部的靶向输送。然而，放射线会增加肿瘤细胞、TILs和小胶质细胞中PD-L1的表达（图9g）。RGD-EV递送可沉默PD-L1的小干扰RNA分子（siPD-L1）可有效抑制PD-L1表达，因此5 Gy X射线辐射和RGD-EV-siPD-L1的联合作用可显著抑制神经胶质瘤的生长。

图9 纳米制剂可实现放射辅助基因递送，从而增强胶质瘤免疫治疗。a) 显示形成靶向固体脂质纳米颗粒 (SLN) 的 iRGD 肽、酯基季铵盐和 DSPE-PEG (2000)-DBCO 的化学结构示意图。b) 联合治疗机制图。c) 接受或未接受放射治疗时，脑内积累的 iRGD-SLN 的体内荧光强度。d) 用所示每种制剂治疗的小鼠脑内 GL261 肿瘤的体内荧光强度。e) 用 RGD 装饰并用 Cy5.5 标记的细胞外载体的配制过程。f) EV 的 TEM 图像。g) 流式细胞术分析 GL261 肿瘤细胞和不同免疫细胞上 PD-L1 的表达水平；h) 接受或未接受放射治疗时，肿瘤中浸润免疫细胞的频率。

越来越多的研究表明，PD-L1 在肿瘤相关髓样细胞 (TAMC) 上过表达，而 TAMC 是驱动肿瘤免疫抑制的关键免疫细胞亚群。为了靶向 PD-L1 + TAMC，Zhang 等人构建了一种抗 PD-L1 mAb 修饰的 LNP（称为 αPD-L1-LNP），用于递送 dinaciclib (Dina)，该药物可抑制与 TAMC PD-L1 产生相关的关键酶，从而增强 CTL 对抗胶质瘤的治疗效果，尤其是与放射疗法联合使用时（图10a）。工程化的 LNP 和 αPD-L1-LNP 的尺寸小于 100 纳米（图10b）。共培养实验表明，TAMC 抑制了 CD8 + T 细胞的增殖扩增，而用 αPD-L1-LNP/Dina 预处理 TAMC 可阻断 TAMC 的抑制功能（图10c）。αPD-L1 的结合增强了 αPD-L1-LNP 对不同 PD-L1+ 免疫细胞亚群，特别是 TAMC 的靶向作用（图10d）。放射线显著增加了 PD-L1 阳性 TAMC 的数量（图10e），从而显著增强了 αPD-L1-LNP/Dina 对胶质瘤的治疗效果（图10f）。放疗联合αPD-L1-LNP/Dina疗法显著减少了胶质瘤中的TAMC和TAM数量（图10f），并显著下调了TAMC上PD-L1的表达（图10h），而单纯放疗则促进了这些免疫抑制细胞的浸润。αPD-L1-LNP疗法在源自胶质母细胞瘤患者的人类TAMC中也表现出了靶向效应。放疗联合纳米免疫疗法在胶质瘤强化治疗的临床转化中具有巨大潜力。

图10 放射疗法增强抗 PD-L1 mAb 修饰脂质纳米颗粒 (αPD-L1–LNP)–dinaciclib 对胶质瘤 PD-L1+ 肿瘤相关髓系细胞 (TAMC) 的免疫治疗作用。a) 工程化抗 PD-L1 mAb-LNP–dinaciclib 的结构以及纳米治疗与放射疗法联合治疗机制的示意图。b) LNP 和 αPD-L1–LNP 的 TEM 图像。比例尺：50 纳米。c) 流式细胞术分析用 CellTrace Violet 引发并与 TAMC 在不同处理下共培养的 CD8 + T 细胞的增殖。d) 流式细胞术分析 rhod（荧光 Ca 2+指示剂）标记的纳米颗粒在不同免疫细胞亚群中的分布。 e) 流式细胞术分析0或8 Gy辐射下PD-L1 + TAMC的百分比。蓝色：同型单抗，红色：抗PD-L1单抗。f) 用不同疗法治疗的胶质瘤小鼠的生存曲线。g) 胶质瘤中不同亚群TAMC的百分比。h) P -L1 + TAMC的比例。i) 源自胶质母细胞瘤患者的纳米颗粒阳性人类TAMC的百分比。

研究发现，放射线可诱导 CXCL12/CXCR4 上调，进而通过扩张血管、促进肿瘤干细胞迁移和免疫抑制性 MDSC 的浸润等多种机制促进神经胶质瘤的生长和转移。CXCL12/CXCR4 拮抗剂 AMD3100 是一种很有前途的治疗候选药物，可逆转 CXCL12/CXCR4 介导的免疫抑制，但 AMD3100 的治疗效果因无法穿过血脑屏障而受到阻碍。最近，Alghamdi 等人设计了 iRGD 修饰的合成蛋白纳米颗粒 (SPNP)，以提高 AMD3100 的血脑屏障穿透能力，用于与放射疗法联合治疗神经胶质瘤。SPNP由人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）和双功能大分子单体（N-羟基琥珀酰亚胺-寡乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺）构成（图11a）。SPNP-AMD3100的尺寸约为100纳米（图11b）。经SPNP-AMD3100和放射处理的胶质母细胞瘤细胞显著促进了免疫原性细胞死亡相关高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放（图11c），从而引发了针对胶质瘤的免疫反应。在放射线辅助下，CXCR4阻断剂SPNP显著延长了OL61胶质瘤小鼠的生存期（图11d、e），并有效阻止了肿瘤复发（图11f），这与通过阻断CXCL12/CXCR4信号传导减少胶质瘤浸润的CXCR4+单核细胞MDSCs，以及诱导ICD触发的记忆反应有关。这种放射疗法与纳米CXCL12/CXCR4拮抗剂的联合疗法，为其临床应用提供了有希望的临床前证据。

图11 修饰有iRGD的合成蛋白纳米颗粒可增强CXCL12/CXCR4拮抗剂AMD3100的免疫治疗功效，尤其是与放射疗法联合使用。a) AMD3100-SPNP制备过程中不同组分的添加顺序。b) AMD3100-SPNP的扫描电子显微镜(SEM)图像。c) 用每种制剂预处理的不同小鼠胶质母细胞瘤细胞释放的HMGB1的酶联免疫吸附测定分析（从左到右：盐水；AMD3100；放射线；AMD3100+放射线）。d) 治疗方案图。e) 植入OL61肿瘤并接受不同治疗或f) 再次接受OL61肿瘤治疗的小鼠的生存曲线。

综上所述，越来越多的证据表明，工程纳米技术不仅能够增强放射治疗介导的肿瘤根除效果，还能重塑肿瘤免疫环境，从而增强免疫治疗。更重要的是，放射疗法通过增强血脑屏障（BBB）穿透能力，增加了纳米治疗药物在脑内的积累。放射治疗介导胶质瘤的免疫原性增强或抑制，具体取决于放射剂量和胶质瘤模型的特征。纳米技术递送的放射增敏剂与免疫药物的协同作用是癌症治疗的有效范例，在临床转化方面具有巨大的潜力。

4.4.4 光动力疗法联合免疫疗法

光动力疗法 (PDT) 是一种相对侵入性较小的癌症治疗方法，其中光敏剂被特定波长的光激活，将能量转移到分子氧，随后产生细胞毒性 ROS 来杀死癌细胞。与倾向于诱导免疫抑制因子的放疗和化疗不同，PDT 会破坏癌细胞以释放免疫遗传性抗原，并引发炎症以分泌促炎细胞因子，促进中性粒细胞和树突状细胞的募集，从而促进针对癌细胞的免疫反应。因此，PDT 和 ICI 的联合疗法代表了一种增强胶质瘤治疗的有效方法。例如，Xu 等人设计了由免疫球蛋白 G (IgG)、氯 e6 (Ce6) 的光敏剂和聚乙烯吡咯烷酮自组装的纳米复合物（≈30 纳米）（图12 a、b）。IgG 促进 Ce6 在胶质瘤中的积累。 Ce6的荧光特性使得术中荧光图像引导手术能够实现精准切除（图12c、d）。术后联合应用PDT和抗PD-L1 mAb可显著延长小鼠的生存时间（图12c）。

图12 Ce6 和 IgG 自组装纳米复合物可用于图像引导光动力疗法 (PDT) 和抗 PD-L1 抗体免疫疗法。a) 联合治疗机制示意图。b) 纳米复合物的透射电子显微镜 (TEM) 图像。比例尺为 50 纳米。c) 植入肿瘤、接受手术和纳米复合物治疗的小鼠的实验时间表和存活率。d) 对荧光图像引导手术切除的肿瘤进行苏木精和伊红染色、Ce6 荧光成像和荧光显微照片分析。

将氧气转化为活性氧 (ROS) 是光动力治疗 (PDT) 疗效的关键，而胶质瘤固有的缺氧环境（富含过氧化氢）会阻碍光动力治疗 (PDT) 的疗效。此外，缺氧会诱导 TAM 极化为促肿瘤 M2 表型，从而加速胶质瘤的免疫抑制环境。为了解决缺氧对治疗的抑制问题，Sunil 等人利用 ROS 响应性硫缩酮连接体与能够产生氧气的 Nutlin-3a 结合，然后与光敏剂原卟啉 IX 一起封装到 DSPE-PEG 胶束中，以增强胶质瘤的治疗效果。

基于细菌的递送系统可以通过多种途径穿透BBB，包括细胞外途径和跨细胞途径。为了增加纳米光敏剂的运输，Sun等人构建了特洛伊细菌系统，负载吲哚菁绿-硅纳米粒子，用于胶质瘤光热免疫治疗（图13a）。 在808nm照射下，吲哚菁绿介导的PDT破坏了胶质瘤细胞和细菌细胞，导致TAA和PAMPs的释放，随后激活DC（图13b）。PDT-细菌介导的原位疫苗接种显著促进效应CD8+T细胞（图13c）和NK细胞在肿瘤部位的浸润 ，从而明显抑制胶质瘤的生长（图13d）。 

图13 负载吲哚菁绿、葡萄糖聚合物和硅纳米粒子的细菌用于胶质母细胞瘤光热免疫治疗。a) 光热免疫治疗机制示意图。流式细胞术分析小鼠接受各种治疗后，b) 成熟树突状细胞 (DC)、c) 胶质瘤浸润性 CD8 + T 细胞的百分比，以及 d) 生物发光原位成像胶质母细胞瘤的大小。

总而言之，纳米平台能够使光敏剂和刺激剂穿透血脑屏障，从而增强胶质瘤的联合治疗效果。通过整合其他免疫原性平台，可以进一步改善这种联合治疗策略。纳米技术增强的光动力免疫疗法是一种颇具吸引力的胶质瘤治疗方法，具有巨大的临床转化潜力。

4.4.5 声动力治疗（SDT）联合免疫治疗

声动力疗法 (SDT) 使用低强度超声波激活选择性积累在肿瘤中的声敏剂，产生 ROS 导致细胞死亡。SDT 是一种很有前途的非侵入性胶质瘤治疗方法。此外，内源性和外源性刺激响应性纳米疗法可实现位点和时间特异性的递送方式，从而安全地治疗癌症，其中响应外部刺激（如辐射、光、超声波和电场）的先进纳米级平台已在免疫疗法和其他治疗方式的联合治疗中显示出良好的效果。例如，Li 等人利用中性粒细胞靶向递送多功能响应性纳米结构，其中 ZnGa2O4 : Cr3 + ( ZGO ) 被一层介孔 TiO2 包覆，并与 PTX 和抗 PD-1 mAb 一起装载在 ROS 响应性脂质体中（图14a）。胶质瘤炎症环境促进中性粒细胞的募集，从而促进纳米治疗药物的积累。ZGO在近红外光照射下具有持续发光。静脉注射后，纳米治疗药物成功到达胶质瘤区域，并通过发光成像检测到（图14b）。超声处理后，TiO 2诱导的ROS生成触发脂质体中PTX和免疫治疗药物（抗PD-1 mAb）的释放，从而产生强大的抗肿瘤作用（图14c），延长了胶质母细胞瘤小鼠的生存期并防止了肿瘤复发。 

图14 中性粒细胞递送的发光纳米增敏剂可实现深度化学/免疫联合治疗，从而有效治疗胶质母细胞瘤。

a) ZnGa2O4 :Cr 3+ (ZGO)@TiO2@ALP（抗 PD-1 抗体、脂质体和紫杉醇的缩写）的配制过程、中性粒细胞辅助 BBB 穿越和胶质母细胞瘤靶向性以及治疗机制的示意图。b) ZGO@TiO2@ALP 在 650 ± 10 nm 发光二极管激发下的长余辉发光图像。c) GL261 肿瘤小鼠静脉注射不同疗法后的发光图像。d) 超声触发不同配方治疗的胶质母细胞瘤小鼠的存活率。

新兴的 SDT 与纳米免疫疗法联合疗法极大地增强了癌症治疗，代表了一种非常有效的治疗范例。然而，这种策略在胶质瘤治疗中很少被探索，需要进一步研究来发掘其潜力。

4.4.6 与免疫疗法联合的其他疗法

铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡，由过量的Fe 2+和磷脂过氧化驱动。该生物过程可通过谷胱甘肽消耗和谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4) 减少来调节，从而通过芬顿反应产生大量的羟基自由基，最终杀死肿瘤细胞。与其他类型的细胞死亡（如细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡）相比，铁死亡的生物学作用在很大程度上尚不清楚，这些细胞死亡已被证明与免疫系统有关。一些实验证据表明，GPX4 功能受损可能诱导脂质免疫刺激物的分泌，从而触发免疫细胞的感知和反应。为了探索铁死亡与纳米治疗中免疫疗法的潜在协同作用，刘等人进行了一项研究。工程小胶质细胞BV2（一种源自C57/BL6小鼠的小胶质细胞）-膜包被的Fe3O4 - siPD -L1纳米复合物通过S-S键连接（图15a）。鉴于小胶质细胞倾向于通过趋化因子被胶质母细胞瘤细胞募集，BV2膜能够促进纳米治疗药物在肿瘤部位的积累，从而增强治疗效果，延长耐药性胶质母细胞瘤小鼠的生存期（图15b）。研究发现，Fe3O4纳米粒子释放的Fe3+下调了GPX4的表达（图15c），从而诱导了神经胶质瘤铁死亡。铁死亡介导的死亡细胞释放的免疫原性肿瘤抗原能够激活树突状细胞（DC），引发抗神经胶质瘤效应T细胞免疫（图15a）。同时，递送的siPD-L1分子成功沉默了神经胶质瘤中的PD-L1表达，从而增强了CTL的细胞毒功能。Fe3O4纳米粒子和siPD-L1的协同作用解释了神经胶质瘤治疗效果的显著增强。

图15 BV2细胞膜共递送Fe3O4和siPD-L1，以增强铁死亡和抗PD-L1免疫疗法对抗耐药性胶质母细胞瘤。a) Fe 3 O 4 –siPD-L1@ M -BV2的制备流程及共治疗机制示意图。b) 不同疗法治疗小鼠的生存曲线。c) 胶质母细胞瘤组织中一些关键蛋白表达的Western印迹分析。

表2总结了用于增强胶质瘤治疗的纳米免疫疗法和联合纳米疗法的实例。无机纳米平台在增强生物稳定性和工程灵活性方面表现出优势，例如可调节的尺寸、形状、粗糙度和手性。然而，大多数进入临床研究的候选药物是有机纳米疗法，它们具有优异的安全性和易于规模化生产的特点（请参阅第5部分的详细信息）。

表2. 纳米材料应用后的胶质瘤免疫治疗及联合治疗

5 新兴纳米技术介导的胶质瘤免疫疗法临床试验

纳米平台中的单一免疫治疗药物或联合治疗药物在临床前动物研究中能够增强治疗效果并减少不良反应，从而推动了其在临床试验中的探索。例如，基于热休克蛋白糖蛋白96 kDa (HSP-gp96) 的载体在临床试验中研究最多（表3）。HSP-gp96是一种细胞内伴侣蛋白，可以天然结合癌胚抗原和祖细胞抗原。HSP-gp96佐剂化的癌症疫苗可以通过CD91受体被树突状细胞（DC）内化，从而协助肽疫苗通过MHC分子呈递，从而增强针对抗原的免疫反应。 HSP-gp96 肽复合物 (简称 HSPPC) 的早期 1/2 期临床试验显示，在 12 名复发性胶质母细胞瘤患者中，11 名出现了明显的外周免疫反应，肿瘤部位出现免疫细胞浸润 (NCT00293423)。令人鼓舞的临床数据促使开展 2 期临床试验，在 41 名患者中进一步证实了 HSPPC 的安全性和有效性。淋巴细胞计数较少的患者生存率较低，这表明治疗前淋巴细胞减少可能影响疫苗的疗效。另一项 1 期临床研究 (NCT02122822) 显示，对于新诊断的胶质瘤患者，HSPPC 疫苗接种联合标准治疗是安全有效的。一项 2 期试验证实了 HSPPC 疫苗接种联合标准治疗对胶质母细胞瘤患者的有效性，结果显示生存率有所提高 (NCT00905060)。在本临床研究中，发现外周髓系细胞PD-L1的表达是影响疫苗疗效的潜在因素，因此另一项正在进行的临床研究正在评估HSPPC-96、抗PD-1 mAb帕博利珠单抗（NCT03018288）和放射治疗联合治疗在胶质母细胞瘤患者中的疗效和安全性。HSPPC疫苗联合抗PD-1（balstilimab）和抗CTLA-4（zalifrelimab）双免疫检查点抑制剂(ICI)也正在接受临床评估（NCT04943848）。在另一项2期临床试验研究（NCT01814813）中，评估了HSPPC疫苗与已获批准的靶向EVGF的人源化mAb贝伐单抗联合治疗在复发性胶质母细胞瘤患者中的疗效，但其结果尚未公布。为了进一步评估HSPPC的安全性和有效性，一项大型2期临床研究（NCT03650257）正在积极招募胶质母细胞瘤患者。鉴于上述广泛的临床研究，基于HSP的癌症疫苗是未来在胶质母细胞瘤患者临床治疗中很有前景的产品。

表3. 纳米技术介导的胶质瘤免疫治疗的临床研究

与HSP纳米技术相结合，直径约为70-90纳米的肿瘤选择性复制型溶瘤腺病毒不仅能够直接解离肿瘤细胞，还能增强抗肿瘤免疫力，是临床试验中胶质瘤免疫治疗的一个重要分支。然而，溶瘤病毒穿透生物屏障的能力较差，这使得它们在腔内注射后无法完全扩散至肿瘤组织。神经干细胞是源自中枢神经系统（CNS）的多能祖细胞，具有穿透肿瘤床的固有能力。因此，这些神经干细胞被改造以递送溶瘤腺病毒CRAd-S-pk7，该病毒经过基因改造，可以更高效地复制并选择性地靶向脑内的胶质瘤细胞。一项1期临床研究 (NCT03072134) 证明，NSC-CRAd-S-pk7 对胶质母细胞瘤患者耐受性良好、安全可行，支持在2/3期临床试验中进一步评估。另一项1期临床研究 (NCT05139056) 正在进行中，旨在评估 NSC-CRAd-S-pk7 多剂量给药对胶质瘤患者的有效性。

除肽疫苗外，mRNA 疫苗正在彻底改变癌症免疫疗法，其在治疗神经胶质瘤方面的实验室和临床探索研究结果都令人鼓舞。例如，编码巨细胞病毒 pp65 负载树突状细胞 (DC) 疫苗的神经胶质瘤病毒抗原的 mRNA 免疫治疗剂被证明具有高效力，在用免疫原性破伤风类毒素预处理免疫部位时，该疫苗可显著抑制小鼠的肿瘤生长。接受破伤风类毒素和树突状细胞疫苗的神经胶质母细胞瘤患者的总生存期显著提高，这与 pp65 特异性免疫反应有关。然而，在树突状细胞疫苗制备中使用电穿孔来增强 RNA 转染可能会导致大量细胞死亡。LNP 具有出色的安全性、稳定性和易于商业化生产的优势，已被商业化用于在临床上递送针对 COVID-19 的 mRNA 疫苗。LNP-mRNA 的这一显著成功促进了对 LNP-mRNA 疗法用于癌症免疫治疗的临床研究的投入。例如，在 LNP 的配方中选择了市售的阳离子脂质 1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷来递送肿瘤来源的 mRNA，从而在静脉注射后显著激活体内树突状细胞 (DC)。与弗氏佐剂辅助肽疫苗相比，工程化的 RNA-LNP 在促进侵袭性高级别胶质瘤小鼠的免疫细胞成熟和增强 T 细胞免疫方面表现出更优异的能力。进一步的动物实验表明，RNA-LNP 通过增加 PD-L1 表达重新编程了全身免疫，使小鼠对 ICI 产生反应。这些有希望的结果支持了一项正在进行的 RNA-LNP 在胶质母细胞瘤患者中的 1 期临床试验 (NCT04573140)，以评估耐受剂量和有效性。

尽管目前只有少数纳米免疫治疗策略正在进行临床研究，但脑免疫学和纳米工程科学的突破性知识将推动神经胶质瘤治疗的新方式并提高其有效性。

6 纳米免疫治疗在临床前和临床研究中的安全性

尽管已有大量研究致力于开发用于治疗胶质瘤的先进纳米免疫疗法，但这些新兴治疗方式的安全性始终是临床前和临床探索中的重中之重。目前，纳米颗粒的尺寸、形状、拓扑结构、溶解度和表面化学性质多种多样。纳米治疗药物在体内发挥作用后，其命运仍不明朗，例如，它们是否会在生理条件下完全降解，在肝脏中被吞噬清除，还是经肾脏排泄。尚未解决的研究问题可能与潜在的纳米毒性有关，而这正是纳米治疗药物临床转化亟待解决的问题。

与有机纳米粒子相比，无机纳米粒子相对惰性。研究人员已应用各种技术，例如利用无创X射线成像在体内追踪金纳米粒子，来了解纳米-生物相互作用、器官内的生物分布以及健康或疾病模型中纳米-细胞相互作用的生物变化。纳米粒子在体内的消除或潜在积累很大程度上取决于其物理化学性质。例如，小尺寸纳米粒子（小于6纳米）往往通过肾皮质清除。表面聚乙二醇化可保护纳米治疗药物免于聚集、蛋白冠形成和循环免疫细胞的吞噬，从而延长其循环时间。对不同动物模型（例如非人类灵长类动物）中生物降解性、清除率和纳米-生物细胞相互作用的基础研究将加速纳米治疗药物的临床转化。

仿生有机纳米粒子，如基于细胞膜的纳米粒子、细胞衍生的载体和细胞外载体系统，是处于临床后期的胶质瘤免疫治疗平台，其安全性已得到充分验证。例如，首次人体试验证明，基于 NSC 的疗法在复发性胶质母细胞瘤患者中耐受性良好，且未检测到剂量限制性毒性。细胞外载体是从各种细胞分泌的纳米大小的囊泡，参与细胞通讯、抗原呈递、肿瘤侵袭和其他生物学功能。鉴于遗传的免疫原性，肿瘤衍生的细胞外载体是治疗性胶质瘤疫苗的绝佳选择，具有出色的安全性。临床上积累的证据证明了 LNP-mRNA 技术的有效性和安全性。这种变革性技术在癌症免疫治疗中受到越来越多的关注，包括胶质瘤 mRNA 疫苗。除了纳米粒子的安全性问题外，免疫毒性（例如免疫相关不良事件）的识别和管理也是一项挑战。开发与人类免疫系统非常相似的可靠动物模型至关重要，这样才能很好地评估、认识和管理纳米平台免疫疗法的副作用和不可否认的益处。目前的临床前实验表明，大多数纳米免疫疗法在体内和体外均表现出低毒性。例如，负载抗 PD-L1 mAb 的 MP-3 共聚物显示出可忽略不计的细胞毒性，静脉注射后主要器官没有明显损害。对于纳米疗法的肝肾毒性，血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶和其他指标的水平在正常范围内，显示出可接受的安全性。除了这些特征之外，促炎细胞因子通常被作为评估健康个体中炎症相关免疫毒性可能性的标志物进行测量。

在外部刺激介导的神经胶质瘤纳米免疫治疗中，应讨论和评估刺激（如放射、光和超声波）的安全性，并考虑外部治疗可能引起的非靶向性和剂量依赖性损伤。例如，辐射会改变纳米粒子的剂量-毒性关系。当暴露于 2 Gy 辐射时，发现金纳米粒子在细胞中的生物相容性显著降低（从 80% 降至 30%）。在神经胶质瘤纳米免疫治疗中，大多数研究是在 2-6 Gy 辐射与纳米疗法相结合的情况下进行的，其中生物安全性测定，如小鼠的体重变化、脑组织的组织学染色和肝肾毒性相关血液标志物分析。

全面评估纳米免疫疗法在临床前和临床研究中的安全性，对于其进一步的临床研究和临床应用至关重要。由于联合治疗策略的复杂性，评估内容涉及体外细胞毒性、蛋白冠状结构、体内生物分布、降解和蓄积、清除途径、免疫疗法的药代动力学、肝肾毒性作用以及炎症介导的免疫毒性等诸多方面。

7 结论和未来展望

免疫疗法彻底改变了癌症患者的治疗方式。然而，恶性胶质瘤仍然普遍致命，免疫疗法疗效甚微。这些失败主要源于一些挑战，这些挑战尤其与大脑相关。胶质瘤是一种极具挑战性的肿瘤病变，其位于复杂的环境中，大脑与宿主免疫系统的物理联系比其他器官的联系更弱。免疫治疗药物难以进入肿瘤部位发挥其生物学功能。胶质瘤异质性极高，且很少发现突变，这使得发现免疫治疗靶点的生物标志物变得困难。胶质瘤严重的免疫抑制特性阻碍了协同联合治疗，例如将标准放疗或化疗与免疫疗法相结合。先进的纳米技术代表了一种有效且有前景的策略，可以改善免疫治疗的疗效，并具有造福胶质瘤患者的巨大潜力。使用具有所需功能的纳米平台可以增强嵌入的免疫治疗药物穿越血脑屏障的能力。通过操纵纳米粒子的化学成分和物理特性，可以利用纳米粒子固有的免疫刺激功能对神经胶质瘤微环境进行额外的免疫调节。除了这些特性之外，在一个纳米平台中结合不同的治疗剂和刺激药物可以最大限度地发挥对抗神经胶质瘤的协同作用。我们在此总结了纳米免疫治疗方法在临床前和临床研究中用于增强神经胶质瘤治疗的最新进展（表2和3）。在这些先进的纳米技术介导的治疗模式中讨论了相关的机制和局部免疫调节，这些模式包括单独的纳米免疫疗法或与化疗、放疗、光动力或声动力疗法相结合。尽管有着不可否认的好处和快速的进步，但新兴纳米免疫疗法在恶性神经胶质瘤治疗中的临床转化仍然面临着若干挑战（图16）。

图16 胶质瘤纳米免疫疗法未来发展方向示意图。

脑与胶质瘤免疫学进展。探索有效的胶质瘤免疫治疗策略的一个主要限制因素是目前对脑免疫机制的认识不足。全面理解浸润于脑和胶质瘤的异质性免疫细胞亚群的分子机制和免疫功能仍然是一项挑战。传统的分子和生物学方法往往只能得到均质脑组织细胞中基因或蛋白质表达的平均水平，而单细胞RNA（scRNA）测序技术于2014年发展起来，能够提供每个细胞的细粒度RNA信息。例如，科学家对健康个体的脑脊液样本进行了scRNA测序，揭示了健康脑衰老过程中单核细胞向克隆性CD8 + T细胞介导的免疫失调发出的信号。通过分析人类神经胶质瘤组织的单细胞RNA测序数据，研究人员发现了九种不同的髓系细胞亚群作为预后标志物，并通过重编程浸润到神经胶质瘤的抑制性髓系细胞和T细胞，将S100A4确定为免疫治疗靶点。在单细胞RNA测序技术中，需要从组织中分离单个细胞，以根据其独特的基因表达谱辨别细胞亚型。空间转录组学技术使科学家能够获取脑组织中一小群细胞在已知位置背景下的转录组数据。这些先进的“组学”技术的整合可在单细胞和空间分辨率下实现高通量分析，为免疫细胞分型和表征其在脑免疫调节中的作用提供先进的策略。脑和神经胶质瘤免疫学方面的先进知识将有助于发现新的有效的免疫治疗靶点。

精准纳米工程策略。免疫治疗药物在血脑屏障（BBB）中的渗透性受限是导致其在胶质瘤治疗中疗效不佳的原因。纳米技术试图通过多种机制加速免疫治疗药物穿过血脑屏障到达胶质瘤部位。例如，具有亲脂性和阳离子特性的小纳米颗粒有利于被动弥散穿过内皮细胞膜或通过紧密连接进行旁细胞转运。纳米颗粒表面结合合适的配体可实现受体介导的转运。目前正在广泛探索的主动靶向途径包括表达于血脑屏障的胰岛素受体、转铁蛋白受体、乳铁蛋白受体、阿片类受体和胰岛素样生长因子-1受体。吸附介导的胞吞转运是一种非特异性策略，通过带负电荷的内皮细胞膜和阳离子纳米颗粒之间的静电相互作用实现。破坏血脑屏障的完整性是改善免疫治疗药物向脑肿瘤部位递送的另一种策略。纳米粒子的结构应经过精确设计，具有独特的所需特性，以增加其进入胶质瘤的可能性，同时应考虑和定制多种因素以达到此目的。

新型胶质瘤TAA的鉴定。组学技术的进步使得我们能够精细分析健康脑组织和胶质瘤组织的免疫特征，这为发现用于特异性免疫治疗的新型TAA提供了可能性。可以通过探索在健康组织中表达量极低但在胶质瘤中过表达的转录本来筛选潜在的胶质瘤抗原。研究人员热衷于定义和鉴定免疫原性肽，这些肽由胶质瘤细胞表达的相应MHC分子自然呈递，并能有效激活针对胶质瘤的免疫反应。尽管已鉴定出许多可用于开发胶质瘤疫苗的TAA，其中一些有希望的候选肽正在临床研究中，但在不同的评估环境中，其治疗效果并不均衡。我们仍然需要创新方法来探索潜在的强效候选肽，即鉴定和验证能够引发强效抗肿瘤免疫反应的高免疫原性肽，尤其是与新兴纳米刺激物结合使用。

密切的跨学科合作。开发强大的纳米免疫疗法需要来自材料科学、神经免疫学、肿瘤学、生物信息学和医学等多学科领域的科学家密切而深入的合作。各个领域的专业人士将贡献其独特的知识、才能和技能，从而提高生产力并促进创新。科学合作是充分理解纳米技术实现胶质瘤免疫治疗机制的决定性因素，最终将为开发有效的纳米免疫疗法提供见解和指导。例如，多组学技术将显著加深对胶质瘤中高度多样性纳米颗粒与高度异质性免疫浸润物之间相互作用的理解，为发现新型生物标志物和建立构效关系带来巨大的机会。然而，大规模单细胞数据带来了诸多挑战，需要制定适当的计算策略。拥有足够计算和生物科学专业知识的生物信息学家能够确保以公正的方式分析海量数据，并通过对原始数据进行精确的质量控制来正确解释。因此，合作团队将应对这些需要广泛知识和能力的挑战，促进安全有效的纳米免疫疗法在胶质瘤治疗中的临床转化。

跨越临床前与临床界限的有效证据交换。临床前研究评估了已在细胞或动物中验证的纳米治疗候选药物的安全性和有效性，其令人鼓舞的结果可能支持其首次人体临床试验。由于有希望的候选药物未能在临床研究中证明其有效性，免疫疗法动物模型在胶质瘤治疗中的相关性往往受到质疑。弥合临床前研究与临床医学之间的巨大差距至关重要。临床医生应与临床前研究人员进行有效的证据交换。临床研究的正面或负面反馈将有助于开发可靠的临床前动物模型，这些模型与人类神经免疫系统和脑肿瘤的特征非常相似。实验室研究人员与临床医生之间的对话将有助于纳米免疫疗法在胶质瘤治疗中的实施。

新兴的纳米工程策略通过增强血脑屏障通透性和增强针对胶质瘤的免疫反应，提高了免疫药物的疗效。尽管先进的纳米免疫疗法单独使用或与其他疗法联合使用在临床前研究中已显示出对胶质瘤治疗的巨大益处，而其临床研究目前仍处于相对落后的阶段，但脑部和胶质瘤免疫领域知识的积累，加上精准纳米技术的进步，将加速纳米技术增强的胶质瘤免疫疗法向临床实践的转化。