2025 年发表于 RAS Drug Discovery

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介绍

RAS（KRAS、NRAS 和 HRAS）是最常突变的癌基因之一，驱动突变主要发生在密码子 12（主要是 V、D、C、R 和 S）、密码子 13（主要是 D 和 C）和 61（H、K 和 R）。由 RAS 突变驱动的肿瘤患者未满足的医疗需求范围仍然非常大，仅在美国每年就有超过 200000 例新病例，并且在三种危及生命的组织型中具有重要代表性：肺癌、结直肠癌和胰腺癌（图13.1）。RAS 的改变导致 GTP 水解中断或 GDP 到 GTP 核苷酸交换加速，其中 RAS 蛋白通常受到严格调节的细胞平衡主要转变为活性的 GTP 结合（RAS（ON））状态。这种转变通过加强与细胞增殖和存活相关的下游效应子和信号通路的激活来促进肿瘤发生。在 RAS 驱动的癌症患者中，针对 RAS 信号通路上游和下游成分的大量治疗努力在很大程度上仍然不成功。KRASG12C突变选择性抑制剂（如 sotorasib 和 adagrasib）最近的临床成功，它们直接靶向KRASG12C的无活性 GDP 结合（OFF）形式，已显示出治疗价值。然而，快速发展的耐药性或第一代（OFF）抑制剂治疗后反应不足表明仍需要新的方法来治疗 RAS 驱动的癌症。

图13.1. 实体瘤中的 RAS 突变。NSCLC1/4非小细胞肺癌;CRC 1/4 结直肠癌;PDAC1/4胰腺导管腺癌。

我们对靶向 RAS 的活性形式感兴趣，因为 RAS-GTP 激活是 RAS 突变癌症中致癌通量增加的驱动因素。从历史上看，直接靶向 RAS-GTP 或 RAS 的“ON”形式一直具有挑战性，因为缺乏可成药的配体结合位点5,6 我们通过与细胞伴侣蛋白形成三复合物开发了一种创新方法，该方法已被证明可以成功靶向一些历史上不可成药的 RAS 突变体，正如共价靶向 RAS（ON） G12C 的 RMC-6291 的设计中所报道的那样。在本章中， 我们描述了 RMC-6236 的发现，RMC-6236 是一种潜在的同类首创、有效、口服生物可利用的 RAS（ON） 多选、非共价、三复合物抑制剂，适用于经典 KRAS、HRAS 和 NRAS 亚型的突变型和野生型变体。

图13.2.  泛 KRAS 抑制剂的例子。

如前所述，sanglifehrin A 是一种对亲环蛋白 A（CYPA）具有高亲和力的天然产物，是 RMC-6236 开发的化学基础。天然产物中保留了最小的 CYPA 结合特征（图13.3），分子的其余部分随后被设计为优化类药物特性，包括溶解度和口服生物利用度，以及与两个伴侣（RAS 和 CYPA）的结合亲和力，以结构引导的多参数优化方法（图13.3）。RMC-6236 重塑 CYPA 表面，以产生对 RAS 活性状态具有高亲和力的新态界面。产生的 CYPA：RMC-6236：RAS 三复合物有效灭活致癌信号传导。

图13.3. 来自 sanglifehrin A 的 CYPA 结合基序（dark salmon [light gray in print version]）与 RMC-6236 中剩余的保守区域的比较。

RMC-6236 在体外和体内癌症模型中在 RAS 成瘾细胞系中表现出显著的抗癌作用，剂量既可耐受又可转化，表明有可能靶向各种致癌和野生型 RAS 亚型，为治疗广泛的 RAS 成瘾癌症提供了一条有前途的途径.截至 2024 年 4 月，RMC-6236 正在作为单一疗法对既往接受过治疗的 晚期实体瘤，包括 NSCLC 和 PDAC，具有 KRAS 甘氨酸 12 突变 （KRASG12X） 基因型 （NCT05379985）。

RMC-6236 的三复合物技术和作用机制

三复合物抑制方法的最初灵感来自自然界中发现的例子，其中雷帕霉素和 FK506 等天然产物已显示出与细胞内伴侣蛋白（如 FKBP12）结合的能力，分别抑制 mTOR 或钙调磷酸酶。因此，我们采用了基于结构的免疫亲和蛋白配体 sanglifehrin A 的重新设计，以指导其配对的内源性免疫亲和蛋白靶向 RAS 的活性状态。Sanglifehrin A以高亲和力结合 CYPA，是一类天然产物的成员，激发了抑制不可成药靶标的范式。

与 sanglifehrin A 一样，RMC-6236 进入肿瘤细胞并与 CYPA 结合。然后，该二元复合物在经典 KRAS、HRAS 和 NRAS 亚型的突变型和野生型变体的 RAS（ON）蛋白表面诱导一个新的结合口袋。在所得的三复合物中，CYPA 空间性地封闭了 RAS 效应子结合面，阻止 RAS（ON）参与其下游效应子以传播致癌信号（图13.4）。

图13.4.RMC-6236 形成三复合物的示意图机制以及 CYPA：RMC-6236：KRASWT（PDB ID 9BG9）三复合物和 KRASWT：CRAFRBD/CRD 复合物（PDB ID 6XI7）的结构叠加。

发现初始化学物质

我们之前报道过化合物 1 的发现，这是一种弱非共价 RAS 抑制剂（图13.5），它最初旨在探测非共价结合的作用，并证明可逆结合足以形成三复合物并破坏多个 RAS 突变体的效应子结合。化合物 1 对多种致癌突变体和野生型 KRAS 表现出弱抑制， NRAS 和 HRAS 蛋白。

最初的 SAR 探索集中在提高突变型和野生型（WT）KRAS、NRAS 和 HRAS 变体（RASMULTI（ON））的细胞效力，同时改善药物样特性并引入口服生物利用度。在寻求 RAS 多抑制剂的过程中，我们不再需要针对 G12C 的扩展接头最初的 SAR 探索侧重于提高突变型和野生型（WT）KRAS、NRAS 和 HRAS 变体（RASMULTI（ON））的细胞效力，同时不断改善类药特性并引入口服生物利用度。在追求 RAS 多重抑制剂，我们不再需要向最初出现这种分子结构的 G12C 位置的延伸接头。因此，我们首先研究了从化合物 1 中去除侧臂以降低分子量（MW）和肽性以得到化合物 2 的影响。化合物 2 在选定的测量 KRAS 突变细胞系中显示出相当的生化 RAS-RAF 破坏、CYPA 结合（KD1）和细胞效力（表13.1）。接下来，我们将注意力转向中心苯基核心的修饰。用噻唑部分取代苯基环导致 CYPA 结合（化合物 3）的显著改善和相当的生化 RAS-RAF 破坏总体上导致细胞效力的显著改善。由于三复合物的作用机制，与生化效力相比，细胞效力的增加是预期的，因为高浓度的 CYPA 会驱动细胞内高浓度的 CYPA：化合物二元复合物。

化合物 3 中的噻唑核心诱导 CYPA 中 R55 残基的运动，导致与含苯基化合物 2 中哌嗪酯羰基的 3.2 A °氢键相比，与化合物 3 中缬氨酸部分的酰胺羰基的 3.2 A ° 氢键相比。此外，化合物 3 噻唑核心中的氮与 CYPA 中的 H126 形成通水相互作用。这两个特征最终导致 KD1 的显著改善 （图13.6）。

潜在优化

化合物 1-3 在小鼠中均表现出低口服生物利用度 （化合物 1 m%F=5;化合物 2 m%F=9;化合物 3 m%F=0.4），这主要受到快速首过代谢的限制。解决代谢稳定性问题是后续轮次的 SAR 优化。我们发现，去除化合物 3 中的乙酰胺并引入刚性尿素部分可产生具有更高效力和口服生物利用度的类似物（表13.2）。

后续轮次的 SAR 优化。我们发现，去除化合物 3 中的乙酰胺并引入刚性尿素部分可产生具有更高效力和口服生物利用度的类似物（表13.2）。

氮杂替丁尿素取代基在 SWI 区与 RAS 形成范德华接触，化合物 6 与 RAS Y32 和 P34 表现出高度的形状互补性，可能导致 WT 和突变体 RAS 抑制的效力提高 >10 倍（图13.7）。化合物 6 在啮齿动物中可接受的口服生物利用度可能是由于溶解度增强和肝脏微粒体稳定性改善的结合，尽管在 Caco-2 系统中测试时表观渗透性 （Papp，AB） 相对较低。

在KRASG12V突变异种移植模型中评估了可逆三复合物抑制剂驱动药效学效应的能力 [图13.8，NCI-H441 （KRASG12V/WT，NSCLC 细胞系衍生的异种移植模型]。以 100mg/kg和 200mg/kg 口服化合物 6 后，给药后 2 小时通路调节最大，通过相对人 DUSP6 mRNA 水平测量，抑制率分别为 86.5% 和 94%。虽然这些数据首次证明非共价三复合物抑制足以驱动体内通路调节，但需要高口服剂量（100mg/kg和200mg/kg）的化合物 6 才能实现理想的血浆暴露和深刻但相当短暂的通路调节。因此，需要进一步优化效力和药物样特性，以最大限度地提高体内靶标覆盖率。

表13.1. 朝向化合物 3 的 SAR。

图13.6. 化合物 2（灰色，PDB ID 9BG4）和化合物 3（橙色 [打印版为深灰色]，PDB ID 9BG1）与 CYPA 和 KRASG12V（为清楚起见而隐藏）共结晶。（A） 化合物 3 的核心噻唑部分与 CYPA H126 形成通水氢键。（B） 当与化合物 2 共聚时，CYPA R55 会与化合物大环的酯羰基形成氢键。当与含有噻唑的化合物 3 形成复合物时，CYPA R55 向酰胺羰基移动并形成更强的氢键。这两个特征导致 KD1 的改善。

表13.2. 关于 aurea 的介绍提供了首个口服生物可利用的 RAS 多靶点工具（化合物 6）。

为了进一步提高效力、特性和口服生物利用度的组合，我们研究了我们是否可以对支架进行更剧烈的改变以找到一个更易处理的起点。我们发现，从桑利莱茵中去除保存的缬氨酸残基并替换为可以延伸到 CYPA 口袋的小药样部分，一起大大降低了分子量，并最终导致了一个步骤代谢稳定性和口服生物利用度的变化（表13.3）。虽然这些变化确实导致 CYPA 结合亲和力（KD1）降低，但我们有点惊讶地发现，生化 RAS-RAF 破坏效力仅受到轻微影响，或者在某些情况下甚至有所改善。

图13.7. 化合物 6 在具有 KRASG12V 的三复合物中的表面显示（PDB ID 9BG7）。化合物 6 的尿素部分的甲氧基氮杂替丁臂在 Y32 和 P34 侧链处与 KRASG12V SWI 形成疏水界面。

图13.8. 化合物 6 的 PK/PD。

以化合物 10 为例的截短刚性接头系列的晶体结构表明，与前面描述的化合物 1 和 3 的结合位点相比，较小的接头允许三KRASG12V的新的、略微扭曲的方向（图13.9A）。在这个新的和扭曲的方向中，KRASG12V Y64 侧链的位置以及它与大环和 CYPA W121 的关键相互作用保持不变（图13.9B）。为了保持 Y64 在扭曲方向的位置，SWII 在新配置中被压缩了超过一埃（图13.9B）。

表13.3. 新截断系列，对 inoralexposure和 MW 有显著改善。

在 KRASG12V 的 SWI 区域中，CYPA和 KRASG12V 之间的氢键受体模式发生变化，同时保持相同的极性相互作用数量（图13.10A）。为了保持 Y64 的扭曲方向，SWII 被压缩了新的配置（图13.10B）。与仅促进 KRASG12V P34 和化合物 10 的甲基环丙基侧链之间相互作用的未旋转取向相反，扭曲取向允许 KRASG12V P34 与化合物 10 的噻唑核心产生额外的疏水相互作用（图13.10C）。这些额外的相互作用使截短的、较低分子量的系列保持相似的KRASG12V结合亲和力，并最终维持细胞活性，同时在跨物种口服暴露谱中获得阶跃改善。

图13.9.（A） 截短的接头化合物允许一种新的三复合物结合模式。KRASG12V绕位于 SWI 和 SWII 之间的轴旋转 19 度，靠近大环的吲哚。（B） KRASG12V Y64 在接受来自 CYPA W121 的氢键的同时，与大环的吲哚和吡啶形成 π 堆叠相互作用。这些交互在旋转和未旋转方向之间保持不变。为了适应 KRASG12V 相对于 CYPA 的总旋转，SWII 主链被压缩得超过一埃，从而产生新的配置（PDB ID 9BG1 和 9BG2）。

图13.10. （A） 在未旋转的方向（蓝色 [打印版中为深灰色] 棒状）中，Ras E31 接受来自 CypA N71 的氢键（红色 [打印版中为灰色] 破折号）。在旋转的方向上，它已经移动并能够与 R69 形成盐桥，同时接受来自 N71 酰胺氮另一侧的氢键（蓝色 [打印版中的浅灰色] 破折号）。（B） 在未旋转的方向上，Ras D33 与 CypA K151（红色 [打印版中为灰色] 破折号）形成盐桥。在旋转方向上，D33 远离 K151，K151 与 D38 形成盐桥。Ras E37 和 D38 处的交互保持不变（蓝色 [打印版本中为浅灰色] 破折号）。（C） 在旋转方向上，SWI 在大循环侧链下移动，填充较小化合物腾出的开放空间。P34 与化合物 11 的噻唑核心和环丙基侧链发生相互作用，而化合物 3 仅在未旋转方向上发生相互作用。

接下来，我们探索了同时提高细胞效力和溶解度的机会，同时保持我们在化合物中实现的较小尺寸和代谢稳定性。需要探索的一个原子有效区域是 SWII 结合口袋中的吡啶环，因为我们的结构分析表明它会夹在 KRASG12V 和 CYPA 之间的任何取代基，因此可能能够同时改善 KD1（CYPA 结合）和 KD2（RAS 结合）。令人欣慰的是，我们发现吡啶与富含 sp3 的胺（例如化合物 12 中的哌嗪）的 meta 取代显著提高了效力和溶解度。这种取代与 W121 形成新的阳离子-pi 相互作用，并在 KRASG12V 上与 M67 形成有利的疏水相互作用（图13.11）。以 KRASG12V 为例，化合物 10 中的氢转化为化合物 12 中的甲基哌嗪导致细胞效力（Capan-1 CTG）提高 100 倍，这是由于 w30X 的 CYPA 亲和力增加以及 w3X 的 KD2 亲和力和 RAS-RAF 破坏效力的增加（图13.11）。与生化效力相比，细胞效力的增加是基于三复合物作用机制的预期，因为高浓度的 CYPA 驱动细胞内高浓度的 CYPA：化合物二元复合物。在调整了细胞内形成的二元复合物的浓度后，生化和细胞效力密切相关，之前已经更详细地描述了 RMC-7977（一种 RAS（ON）多选工具）和 RMC-6236（化合物 12）。

图13.11. 化合物 12 中的甲基哌嗪与 CYPA 形成新的阳离子 pi 相互作用，并与 KRASG12V 的 M67 形成疏水相互作用 （PDB ID 9BG6）。

RMC-6236 开发候选产品简介

化合物 12（RMC-6236）最终被选为 RAS（ON）多选择性候选药物，基于细胞效力、溶解度、良好的体外效价和跨多个物种的体内 PK 谱的良好组合。RMC-6236 在单剂量静脉注射后在稳态下表现出低至中度的血液清除率和中等分布容积，并且在小鼠、大鼠、狗和食蟹猴中表现出可接受的口服生物利用度（24-3%）。在小鼠中，RMC-6236 在 10-100 mg/kg 的剂量下表现出近似线性的 PK。根据体外和体内跨物种 ADME/PK 特性，预计 RMC-6236 在日常给药后可用于临床用途（表13.4）。

RMC-6236 抑制突变型和野生型 K、N 和 HRAS

RMC-6236 占据 CYPA 和 RAS 的 SW 区域之间的诱导结合口袋，类似于先前描述的三复合物抑制剂，并沿 Q61-G12-G13 轴留下一个未占据的凹槽。绝大多数致癌突变发生在 RAS 上的这三个位置，这个凹槽能够容纳大块的突变侧链（图13.12）。此外，CYPA 和 RMC-6236 仅与 RAS 的保守效应子结合叶和 H、K 和 NRAS 之间的亚型差异位于三复合物界面的远端。

使用对 GMPPNP 负载的 RAS 与 RAS 效应蛋白的 RAS 结合域（RBD）之间相互作用的破坏敏感的 TR-FRET 测定对 RMC-6236 对多种 RAS 突变体和亚型的抑制活性进行生化表征。野生型 KRAS、NRAS 和 HRAS 破坏 BRAF 结合的效力几乎相同，并且不同 RAS 突变体的破坏效力变化约为 10 倍。RMC-6236 有效降低了 12 种细胞系中的细胞磷酸化 ERK（RAS 激活的标志物）和细胞增殖，这些细胞系代表了一系列 RAS 突变，包括野生型 K、N 和 HRAS 以及 KRAS G12V、G12C、G12D、G12R、G13D 和 Q61H 以及 NRASQ61R（图13.13）。

表13.4. RMC-6236 开发候选者概况。

图13.12. 如 RMC-6236 X 射线结构所示，结合模式沿 Q61-G12 G13 轴形成一个凹槽，RAS 多选择性化合物留下一个包含常见致癌突变残基 G12、G13 和 Q61 的凹槽未被占据。这为类似于 RMC-6236 的化合物提供了结合多种 RAS 变体（PDB ID 9BG6、9BG9、9BGA、9BGC、9BG5、9BGB、9BG0、9BG8、9BG3 和 9BGD）的结构基础。

RMC-6236 临床前活性

RMC-6236 在体外抑制多种人 RAS 成瘾癌细胞系中的 ERK 磷酸化和细胞生长，并且在体内 RAS 突变癌症的临床前异种移植模型中，单剂量诱导剂量依赖性、深度和持久抑制 RAS 通路激活长达 48 小时。在一组具有 RAS 突变癌症代表性异种移植模型的小鼠临床试验中， 每天给药的 RMC-6236 推动了多种组织型的深度肿瘤消退，包括 PDAC 、 NSCLC 和 CRC，并且耐受性良好。与体外数据一致，携带 KRAS 甘氨酸-12 取代（KRASG12X），包括 KRASG12D，KRASG12V，KRASG12C 和 KRASG12R 突变的异种移植模型表现出更高的反应率和更高的持久的反应，与这些模型中的 RAS 癌基因成瘾一致（图13.14）。

图13.13. RAS 突变体和 WT 的 RMC-6236 活性。

图13.14. RMC-6236 在小鼠临床试验中的活性。

我们还证明，RAS（ON）多重抑制谱有可能克服临床上观察到的 KRASG12C（OFF）抑制剂的许多耐药机制，并且在与突变选择性 RAS（ON）抑制剂同时使用时显示出组合活性。

结论

RMC-6236 是一种有效的、口服生物可利用的 RAS（ON）多选择性三复合物抑制剂，可将三复合物抑制剂策略扩展到非共价靶向 WT 和多种致癌 RAS 变体蛋白的活性状态。这为一系列 RAS 成瘾癌症（包括 NSCLC、CRC 和 PDAC）提供了独特的治疗机会。在细胞中，RMC-6236 与 RAS（ON）和 CYPA 形成三复合物，通过空间闭塞驱动 RAS 效应子结合的近乎立即的破坏和 RAS（ON）信号传导的消失。RMC-6236 结合多个 RAS 变体，因为它占据一个诱导结合口袋，并留下一个包含常见致癌突变热点 G12、G13 和 Q61 的凹槽未被占据。RMC-6236 在各种 RAS 突变异种移植模型中在耐受性良好的剂量下显示出强大而持久的抗肿瘤活性，并为直接靶向活性 RAS 变体作为一种理想的治疗策略提供了临床前验证。截至 2024 年 4 月，RMC-6236 正在一项正在进行的 Ph1/1b 临床试验（NCT05379985）中对 KRASG12X 突变实体瘤患者进行临床评估。

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