2025年3月3日 发表于 Molecular Therapy

摘要

高级别胶质瘤 (HGG)，包括成人胶质母细胞瘤 (GBM) 和儿童弥漫性内生性脑桥胶质瘤 (DIPG)，是最具侵袭性和致死性的脑肿瘤之一。其顽强生存的关键因素在于胶质瘤干细胞 (GSC) 的存在，GSC 是肿瘤发生、发展和耐药性的驱动因素。靶向并清除 GSC 有望治愈 GBM 和 DIPG。自然杀伤 (NK) 细胞作为先天免疫系统的一部分，能够识别并破坏恶性细胞。基于 NK 细胞的疗法，例如嵌合抗原受体 (CAR)-NK 细胞、NK 细胞衔接器和 NK 细胞衍生的外泌体，的最新进展为治疗 GBM 和 DIPG 提供了有前景的方法，尤其是通过解决 GSC 的持续存在。本综述重点介绍了这些进展，探讨了血脑屏障和免疫抑制肿瘤微环境等挑战，并提出了改进和临床推进这些基于 NK 细胞的 HGG 疗法的未来方向。

介绍

高级别胶质瘤 (HGG) 是一类高度侵袭性且往往致命的脑肿瘤，影响成人和儿童。根据恶性程度和生长速度分为 3 级或 4 级，这些肿瘤包括一些最危险的胶质瘤类型，例如成人的胶质母细胞瘤 (GBM) 和儿童的弥漫性内在性脑桥胶质瘤( DIPG)。GBM 每年在美国造成超过 15,000 人死亡。标准治疗包括手术切除，然后进行放疗和替莫唑胺 (TMZ) 化疗。然而，尽管采取了这些干预措施，预后仍然不容乐观，中位生存期不到 15 个月。DIPG主要影响 5 至 10 岁的儿童，其破坏性同样巨大。这种无法手术的脑干肿瘤位于脑桥，表现为严重的神经系统症状，并且与胶质瘤 (GBM) 一样对放疗和化疗有耐药性。DIPG 的中位生存期不到 1 年。GBM和DIPG 持续存在和复发的主要因素是神经胶质瘤干细胞 (GSC)。GSC在启动和维持肿瘤生长方面非常有效，并且对标准疗法有耐药性。靶向和消除GSC 可能为GBM和DIPG提供潜在的治疗方法。

自然杀伤 (NK) 细胞是先天免疫系统中的关键参与者，因其无需事先致敏即可靶向和消除癌细胞的能力而备受关注。先前的研究表明， NK 细胞优先攻击干细胞样癌细胞，而不是分化癌细胞。NK细胞存在于 GBM 和 DIPG 的微环境中，NK 细胞发挥与癌细胞增殖无关的细胞毒作用，使其对增殖和休眠 GSC 均有效。基于 NK 细胞的疗法的最新进展，例如嵌合抗原受体 (CAR)-NK 细胞、NK 细胞衔接器和 NK 衍生的外泌体，在消除各种类型癌细胞方面显示出巨大潜力，为改善 GBM 和 DIPG 等 HGG 的预后提供了一种有希望的策略。

本综述对胶质母细胞瘤 (GBM) 和浸润性胶质母细胞瘤 (DIPG) 进行了深入分析，重点探讨了它们的侵袭性和治疗耐药性所带来的挑战，尤其是由于 GSC 的作用。综述讨论了 NK 细胞在肿瘤微环境 (TME) 中的作用，并重点介绍了基于 NK 细胞的癌症疗法的最新进展。此外，综述还指出了 NK 细胞疗法发展过程中面临的障碍，并探讨了在成人和儿童患者中对抗 HGG 的未来方向。

胶质母细胞瘤 (GBM) 和胶质干细胞 (GSC)

GBM 是成人最常见、最致命的恶性脑肿瘤，占所有原发性脑肿瘤的近一半。其侵袭性给治疗带来了巨大的挑战。GBM 通常发生在大脑半球，最常影响额叶和颞叶，但也可发生在其他区域，包括顶叶和枕叶。肿瘤的位置通常决定了头痛、癫痫、认知障碍和运动障碍等临床症状。它可以发展为原发性肿瘤，在没有先前的低级别胶质瘤(LGG) 的情况下出现，也可以发展为继发性肿瘤，从先前存在的 LGG 发展而来。一个关键的分子标记是异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 基因的突变状态。IDH 突变型 GBM 通常来自 LGG，侵袭性较低，而更常见的 IDH 野生型 GBM 预后较差。

癌症基因组图谱 (TCGA) 将胶质母细胞瘤 (GBM) 分为三种主要分子亚型：原神经型 (PN)、经典型 (CL) 和间质型 (MES)。这些亚型以特定的基因改变为特征，在临床行为和药物反应上有所不同，导致放疗、化疗和靶向治疗等多模式疗法的失败。例如，表皮生长因子受体 (EGFR) 扩增和突变在 CL 亚型中很常见，而 MES 亚型与 NF1 突变和免疫细胞浸润增加有关。然而，最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究表明，这些亚型在单个肿瘤内并非严格划分的。多种亚型可能共存于同一肿瘤的不同区域内，并且分子特征会随着时间和治疗反应而发生变化。对于 GBM 细胞，scRNA-seq 已鉴定出四种细胞状态：(1) 神经祖细胞样 (NPC 样)、(2) 少突胶质细胞 (OC) 祖细胞样 (OPC 样)、(3) 星形胶质细胞样 (AC 样) 和 (4) MES 样。这些细胞状态与TCGA亚型相符，其中CL 和 MES 亚型对应于 AC 样和 MES 样状态，而 PN 亚型对应于 OPC 样和 NPC 样状态。这种表型可塑性，即肿瘤细胞可以根据基因突变或环境变化在不同状态之间切换，对治疗提出了巨大挑战。针对单一亚型通常是不够的，因为 GBM 肿瘤由处于多种细胞状态的细胞组成，这些细胞可以在整个治疗过程中适应和进化。

GSC 是胶质母细胞瘤 (GBM) 持续存在和复发的关键，GSC 表现出干细胞样特性，例如自我更新和分化为各种肿瘤细胞类型的能力。它们利用增强DNA修复、药物外排和静止等机制来逃避治疗，使其成为肿瘤进展和复发的关键驱动因素。GSC在缺氧环境中茁壮成长，这提高了它们的存活率并促进肿瘤生长。识别 GSC 的关键分子标记包括 CD133，一种与增加的致瘤潜力和治疗耐药性相关的跨膜糖蛋白；SOX2，一种对维持细胞干性和可塑性至关重要的转录因子；Nestin，一种与神经祖细胞样状态和肿瘤侵袭性相关的中间丝蛋白； CD44，是一种细胞表面糖蛋白，可作为透明质酸受体，促进细胞间相互作用、粘附和在细胞外基质 (ECM) 内迁移；醛脱氢酶，是一个将醛转化为羧酸进行解毒所必需的酶家族；OLIG2, 是一种对 OC 发展很重要的转录因子。然而，寻找通用的 GSC 标记仍然存在争议，主要是因为患者之间和肿瘤内的差异很大。scRNA-seq 的最新进展揭示了 GBM 中的四种主要 GSC 细胞状态：NPC 样、OPC 样、AC 样和 MES 样，每种状态都与不同的干性标记相关。具体来说，CD133 与 OPC 样细胞相关，CD24 与 NPC 样细胞相关，CD44 与 MES 样细胞相关。这种表型可塑性，加上 EGFR、PDGFRA、CDK4 和 NF1 的基因变异，影响了 GSC 的行为，使其能够进一步逃避治疗干预并促进肿瘤再生。

DIPG 和 GSC

DIPG 是最致命的儿童脑肿瘤之一，约占儿童脑肿瘤的 10%–15%。确诊后，中位生存期约为 11 个月，不到 10% 的患者能存活超过 2 年。DIPG位于脑桥，这是脑干的重要组成部分，负责调节呼吸、心率、睡眠和运动控制等基本功能。因此，DIPG 会严重扰乱这些过程，导致严重的神经系统症状。侵入性 DIPG 细胞会扭曲和破坏神经纤维，进一步导致神经功能衰退。58由于其浸润性质和位于脑干，DIPG 极难通过手术治疗。由于肿瘤固有的耐药性，化疗等当前疗法基本上无效，而放射疗法只能提供暂时缓解，仅将生存期延长几个月，而无法阻止肿瘤进展。这种惨淡的预后凸显了对新治疗方法的迫切需求。

驱动 DIPG 行为的关键基因改变之一是 H3K27M 突变，在约 70%–80% 的病例中发现。这些肿瘤现在被归类为弥漫性中线胶质瘤 (DMG)，H3K27 改变，以组蛋白 H3 基因突变为特征。这种突变通过抑制多梳抑制复合物 2 (PRC2) 来破坏正常的染色质调控，导致 H3K27 三甲基化的整体丧失并导致广泛的基因表达失调。最近的scRNA -seq研究已经确定了 H3K27M DIPG 中的三种不同细胞状态：OPC 样、OC 样和 AC 样。值得注意的是，代表未分化祖细胞的 OPC 样细胞占肿瘤群体的 80% 左右，表明分化受阻并突显了该疾病的侵袭性。此外，20%–30% 的 DIPG 病例缺乏 H3K27M 和 IDH 突变。这些肿瘤被分为 DIPG、H3 野生型和 IDH 野生型 ，但其潜在的遗传驱动因素仍不太清楚，这凸显了对这些亚型进行进一步研究的必要性。

越来越多的研究发现，GSC 是 H3K27M DIPG 侵袭性和治疗耐药性的关键驱动因素。H3K27M 突变通过抑制 PRC2 功能破坏 OPC 的正常分化，导致未分化细胞的积累。在H3K27M改变的 DIPG 细胞中观察到独特的干细胞样特征，这些细胞表现出干细胞标志物（如 Bmi1、Nestin、CD15 和 SOX2）表达升高。这些与自我更新和干细胞维持相关的标志物表明这些肿瘤保留了显著的干细胞样特征。DMG 细胞系（如 HSJD-DIPG-007和 HSJD-DIPG-012）表现出强大的自我更新能力，可以从单个细胞形成神经球，进一步支持它们的干细胞样行为。SOX2 是调节干细胞多能性的关键转录因子，在这些细胞中明显过度表达。这种干细胞样特征，加上突变对染色质和表观遗传调控的影响，强调了 GSC 的侵袭性，并强调了开发有效疗法的挑战。

TME 中的 NK 细胞

NK细胞是先天免疫系统的重要组成部分，具有识别和消除病毒感染或肿瘤细胞的独特能力，使其成为关键的第一道防线。它们起源于骨髓中的淋巴祖细胞并在血液中循环。NK 细胞的特点是表达 CD56 而没有 CD3，这使它们有别于 T 细胞。它们分为两个亚群：CD56 bright CD16 dim / −细胞和 CD56 dim CD16 +细胞。CD56 bright CD16 dim/−细胞主要位于淋巴组织中，以产生干扰素-γ (IFN-γ) 等细胞因子而闻名，这些细胞因子在调节适应性免疫和先天免疫反应中起关键作用。这些细胞本身不具有细胞毒性，但它们在激活后会表现出细胞毒性。相反，CD56 dim CD16+细胞主要存在于外周血 (PB) 中，因其强大的细胞毒性和诱导靶细胞凋亡的能力而闻名。

NK 细胞通过整合来自两种表面受体（激活受体和抑制受体）的信号发挥作用（图1）。激活受体（例如 NKG2D、NKp30、NKp46 和 DNAM-1）通过识别异常细胞上的应激诱导配体或病原体相关分子来触发 NK 细胞活化，从而消除癌细胞和病毒感染细胞。相反，抑制受体（包括 CD94/NKG2A 和 LILR）可识别健康细胞上的自身分子，如主要组织相容性复合体 (MHC) I 类蛋白，发出“不杀死”信号以防止正常组织受损。缺失自我理论进一步解释说， NK细胞可以识别和靶向缺乏这些自身 MHC I 类分子的细胞，因为它们的缺失会消除抑制信号，从而促使 NK 细胞活化。激活信号和抑制信号之间的平衡确保 NK 细胞有效靶向患病细胞，同时保持免疫耐受性并防止自身免疫（表1）。肿瘤细胞通常通过下调 MHC I 类来逃避 T 细胞，使其更容易受到 NK 细胞介导的杀伤。一旦被激活，NK 细胞就会释放含有穿孔素（在靶细胞膜上形成孔隙）和颗粒酶的细胞毒性颗粒，颗粒酶进入细胞诱导细胞凋亡。此外，NK 细胞可以通过死亡受体信号传导触发细胞凋亡，其中 NK 细胞上表达的肿瘤坏死因子 (TNF) 相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 或 Fas 配体 (FasL)（图1）与靶细胞上的相应受体结合，激活凋亡途径。NK 细胞还分泌 IFN-γ 等细胞因子，可募集其他免疫细胞并调节适应性免疫。另一个关键机制是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)，其中 NK 细胞通过其 Fcγ 受体 CD16 与靶细胞上的免疫球蛋白 G (IgG) 抗体的 Fc 区结合，引发导致细胞毒分子释放和细胞消除的级联反应。

图1 NK细胞抑制和激活受体

表1 NK细胞受体及其相应的肿瘤细胞配体

肿瘤不仅仅是大量癌细胞，而是一个称为 TME 的复杂生态系统。该环境包括癌细胞、癌相关成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、周细胞、ECM 和各种分泌分子。ECM 提供结构支持，而癌细胞与周围细胞之间的相互作用则通过直接接触或信号分子（如细胞因子、趋化因子和细胞外囊泡）发生。这些相互作用可导致免疫抑制，使肿瘤逃避检测。TME 内的免疫抑制细胞，包括髓系抑制细胞 (MDSC) 和调节性 T细胞(Treg)，通过抑制抗肿瘤免疫反应对肿瘤进展至关重要。 MDSC 通过多种途径抑制 T 细胞和 NK 细胞的活化和增殖，包括活性氧的产生和免疫抑制细胞因子的分泌，如转化生长因子 β (TGF-β) 和白细胞介素 10 (IL-10)。同样， Treg可以通过产生相同的细胞因子来抑制效应 T 细胞和 NK 细胞的活性。外泌体是由包括癌细胞在内的各种细胞类型分泌的小型膜结合细胞外囊泡 (30-150 纳米)，是 TME 的另一个重要组成部分。这些外泌体通过转移反映来源细胞的生物活性分子（如脂质、核酸、代谢物和蛋白质）来促进细胞间通讯。肿瘤细胞释放的外泌体具有强大的免疫抑制特性，可改变 TME 内的免疫状况。这些外泌体可以携带免疫抑制分子，例如程序性细胞死亡配体 1 (PD-L1) 和 TGF-β，它们抑制效应 T 细胞和 NK 细胞的活性，同时促进免疫抑制细胞群（例如 Treg、MDSC 和调节性 B 细胞）的扩增。此外，肿瘤来源的外泌体会干扰髓系祖细胞的成熟，促进巨噬细胞极化为支持肿瘤的 M2 表型，并阻碍中性粒细胞的募集，从而使肿瘤逃避免疫检测和监视。总之，肿瘤微环境中的这些细胞和分子相互作用为肿瘤生长和免疫逃逸创造了一个支持性环境。

尽管 NK 细胞具有强大的抗癌能力，但它们在肿瘤微环境中仍面临着各种挑战，这些挑战严重损害了它们的功能。细胞外基质 (ECM) 可以形成物理屏障，阻止 NK 细胞浸润到肿瘤组织中，从而限制其到达和清除肿瘤细胞的能力，尤其是在血管稀少的区域。另一个主要障碍是免疫抑制因子的存在。TGF-β 抑制关键 NK 细胞活化受体（例如 NKG2D）的表达，并减少细胞因子（例如 IFN-γ）的产生，而细胞因子的产生对于抗肿瘤免疫至关重要。前列腺素 E2 是 TME 中的一种免疫抑制分子，它可以下调活化受体并促进 NK 细胞中的抑制通路。缺氧或低氧水平会改变 NKp44、NKp46、NKp30 和 NKG2D 等激活受体的表达，并减少 NK 细胞细胞因子的分泌，从而削弱其识别和杀死肿瘤细胞的能力。肿瘤细胞还可以利用NK 细胞抑制性受体，通过上调这些受体的配体来逃避杀伤。与 T细胞类似，NK 细胞可以表达检查点受体 PD-1。当 PD-1 与肿瘤细胞上的配体 PD-L1 结合时，NK 细胞就会耗竭，失去细胞毒能力。表2 概述了肿瘤逃避 NK 细胞介导的免疫监视的主要机制。应对这些挑战是推进 NK 细胞免疫疗法的主要目标，重点是恢复或增强 NK 细胞功能，以更有效地靶向和消除肿瘤。

表2 肿瘤逃避NK细胞免疫监视的机制

基于 NK 细胞的癌症疗法

基于NK细胞的癌症疗法利用NK细胞的杀伤功能来靶向并摧毁肿瘤细胞，为癌症免疫治疗提供了一种有前景的方法。这些策略包括CAR-NK细胞、NK细胞衔接器、NK外泌体以及其他创新策略（图2）。

图2 基于NK细胞的癌症疗法

细胞来源

NK 细胞的来源是决定其在 NK 细胞疗法中的临床有效性和可扩展性的关键因素（图3）。原代 NK 细胞来源于外周血 (PB)、脐带血 (CB) 或造血干细胞祖细胞，在癌症免疫疗法中至关重要，因为它们具有通过激活 NKG2D 和 CD16 等受体识别和清除肿瘤细胞的天然能力，而 CD16 有助于 ADCC。自体 NK 细胞来自患者自身的免疫系统，可使用 IL-2、IL-12、IL-15 和 I 型 IFN 等细胞因子激活，以增强其抗肿瘤功能。虽然自体 NK 细胞可以提供个性化治疗，但由于免疫抑制性 TME，其在癌症患者中的有效性通常会降低。相比之下，来自健康供体的同种异体 NK 细胞表现出更强的细胞毒性，尤其是在接受造血干细胞移植的患者中，供体的 NK 细胞可以抵消 TME 诱导的免疫抑制。永生化NK 细胞系，例如 NK-92、KHYG -1、和NKL，提供了可扩展且一致的治疗来源，其中 NK-92 是临床试验中唯一的细胞系。然而，NK-92 细胞缺乏 CD16 表达，限制了它们的 ADCC 潜力，并且需要照射以防止致瘤性。诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的 NK 细胞提供了一种可扩展且可再生的选择，能够实现具有一致质量和增强工程潜力的现成疗法，尽管它们的生产耗时且成本高昂，并且它们的长期安全性仍在研究中。在抗肿瘤活性方面，NK-92 细胞表现出强大的功效，尤其是在用 CAR 改造时；然而，它们缺乏 CD16 限制了它们与单克隆抗体协同作用的能力。原代 NK 细胞因其成熟的表型和较高的 ADCC 潜力而表现出较强的细胞毒性。虽然 iPSC 衍生的 NK 细胞与原代 NK 细胞和 NK 细胞系相比，其基线细胞毒性较低，但其功能可通过基因工程改造增强，凸显了其在推进基于 NK 细胞的癌症免疫疗法方面的潜力。

CAR-NK细胞

CAR-NK 细胞技术利用 NK 细胞固有的细胞毒性，同时整合了工程化受体的肿瘤靶向精度。与 CAR-T 细胞一样，CAR-NK 细胞经过工程化改造，可表达能够识别癌细胞特定抗原的 CAR。传统 CAR-NK 细胞由 CAR 结构组成，该结构包含胞外单链可变区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。下一代 CAR-NK 细胞融合了创新功能，例如针对多种抗原的双靶向受体、分泌 IL-15 等细胞因子以增强持久性的装甲 CAR，以及阻断 PD-L1 等免疫检查点的模块，从而抵消肿瘤诱导的免疫抑制。将CAR - NK 细胞与单克隆抗体或检查点抑制剂相结合已显示出改善治疗效果的潜力。比较 CAR-T 和 CAR-NK 疗法时，两者均显示出不同的优势和挑战。由于 CAR-T 细胞具有抗原特异性细胞毒性、长持久性和记忆 T 细胞形成能力，它们在血液系统恶性肿瘤中显示出显著的疗效。然而，它们在实体瘤中遇到了很大的局限性，包括对 TME 的敏感性以及在同种异体环境中细胞因子释放综合征 (CRS)、神经毒性和移植物抗宿主病的风险。相反，CAR-NK 细胞结合了先天性和 CAR 介导的细胞毒性，使它们能够靶向具有异质抗原表达的肿瘤，并在 TME 内更有效地发挥作用。它们还表现出卓越的安全性，将 CRS 和神经毒性的风险降至最低，并且可以使用 CB 和 iPSC 等来源生产成现成的疗法。尽管具有这些优势，CAR-NK 细胞仍面临着诸多挑战，例如体内持久性有限、难以浸润实体瘤、免疫抑制性肿瘤微环境 (TME) 以及抗原下调，这些因素可能会降低治疗效果。此外，对于中枢神经系统癌症（例如 HGG），全身给药必须克服血脑屏障 (BBB) 等物理屏障，这对 CAR-NK 疗法构成了重大障碍。

NK 细胞衔接器

NK 细胞接合器 (NKCE) 是经过工程改造的、基于抗体的分子，旨在靶向癌症或感染细胞。这些分子主要有两种形式：双特异性杀伤细胞接合器 (biKE) 和三特异性杀伤细胞接合器 (triKE)。NKCE的作用是同时结合 NK 细胞和癌细胞上的肿瘤特异性抗原，使它们紧密接近并激活 NK 细胞以更有效地杀死靶细胞。理想情况下，肿瘤抗原应为在癌细胞中过表达的细胞表面蛋白，从而最大限度地提高 NKCE 识别和靶向癌细胞的能力。NK 细胞受体的选择也同样重要。NKCE 中最常用的 NK 细胞受体之一是 CD16，它以能够完全激活 NK 细胞而无需其他受体的共同激活而闻名。136其他受体，如 NKG2D、NKp30、和NKp46 也可使用，具体取决于它们提供的特定优势。在triKE 中，NK 受体和肿瘤细胞抗原通过 IL-15 成分连接，从而促进 NK 细胞生长、活化和存活（图S1）。临床前研究表明，triKE 在治疗卵巢癌、高危骨髓增生异常综合征和晚期系统性肥大细胞增多症等癌症方面有良好的效果。虽然 NKCE 具有许多优势，例如增强的特异性和免疫激活，但它们也带来了挑战。这些挑战包括在体内的半衰期短和潜在的尺寸限制，这可能会阻碍它们穿透致密肿瘤的能力。

NK 细胞外泌体

NK 细胞来源的外泌体的形成始于 NK 细胞质膜内陷，在此过程中形成早期内体，其包裹各种大分子。随着早期内体成熟为晚期内体，它会对其大分子内容物进行进一步的分选和包装。随后，晚期内体与 NK 细胞的质膜融合，将外泌体释放到 ECM 中。分泌后，NK 细胞外泌体会与靶细胞相互作用，运送其分子货物以发挥其功能。NK 细胞外泌体保留了其亲本 NK 细胞的特征，包括 CD16、CD69、NKp44 和 NKG2D 等表面标志的表达。它们携带细胞毒性分子，如 TNF-α、颗粒酶 A/B 和穿孔素，并显示跨膜蛋白，如 FasL 和 TRAIL，可诱导肿瘤细胞中 caspase 依赖性和 caspase 非依赖性凋亡。NK 细胞外泌体在癌症治疗中的主要优势是其体积小，这使它们能够有效地在肿瘤血管中导航，以及它们在酸性环境中的适应力。最近的研究强调了它们对各种癌症的有效性，证明对黑色素瘤和乳腺癌具有显着的细胞毒活性。然而，尽管前景广阔，但 NK 细胞外泌体在脑肿瘤中的临床前和临床验证仍处于早期阶段，需要进一步研究以评估其长期安全性和有效性。

针对 HGG 中的 GSC 的 NK 细胞疗法

GSC 在 HGG 的发生、发展和治疗耐药性中发挥着关键作用，这使其成为创新治疗方法的关键靶点。最近的研究表明，NK 细胞可以在体外有效靶向和破坏 GSC 肿瘤球，这为改善治疗效果带来了希望。然而， NK 细胞消除GSC的成功并不总能得到保证，通常取决于它们在 TME 内的激活情况。HGG通过促进缺氧、上调免疫抑制分子（如 TGF-β和IL-10）以及募集调节细胞（包括 MDSC 和肿瘤相关巨噬细胞）来创建“冷”TME。这些因素会削弱 NK 细胞识别和破坏 GSC 的能力。此外，GSC 会下调激活配体，进一步降低 NK 细胞功效（图4）。GSC 的异质性加剧了这些挑战，因为这些细胞在分化的不同阶段表达不同的表面标志，使得 NK 细胞难以持续识别和靶向它们。

图4 HGG的TME中的GSC-NK相互作用

为了增强NK细胞对抗HGG的疗效，研究人员一直在研究多种策略。NKG2D配体家族包含多种应激诱导蛋白，包括MHC I类链相关蛋白A (MICA)、MICB和ULBP（UL16结合蛋白）亚家族，这些蛋白在癌细胞表面表达。这些配体与NK细胞上的NKG2D受体结合，触发NK细胞活化和细胞毒性，从而促进癌细胞的清除。然而，胶质母细胞瘤（GBM）中的生殖干细胞（GSC）已被证实会下调NKG2D配体，从而导致对NK细胞介导的杀伤产生抵抗。因此，靶向NKG2D配体是一种增强HGG中生殖干细胞NK细胞疗法的有效策略。表观遗传修饰在调节基因表达（包括NKG2D配体的表达）中起着至关重要的作用。先前的研究表明，靶向环状 EZH2 编码的蛋白质 EZH2-92aa 可通过激活 NKG2D 配体促进 NK 细胞介导的体外和体内GSC 清除。另一项研究强调，表观遗传调节因子组蛋白去乙酰化酶 8 (HDAC8) 调节神经胶质瘤细胞中 NKG2D 配体的表达，抑制 HDAC8 会增加 NKG2D 配体的表达，从而增强 NK 细胞介导的细胞毒性。微小RNA (miRNA) 是一种小型非编码 RNA 分子，通过靶向 mRNA 和调节基因表达，代表了一种重要的表观遗传调控机制。它们在调节 NK 细胞功能（如细胞毒性、增殖和细胞因子产生）中起着关键作用。例如，在人类原代 NK 细胞中过度表达 miR-362-5p 可通过靶向圆柱瘤病 (CYLD) 基因（核因子 κB 信号转导的负调节剂）来增强 IFN-γ、穿孔素、颗粒酶 B 和 CD107a 等细胞毒性分子的表达。类似地，miR-155 可增强 NK 细胞在 IL-2、IL-15 和 IL-21 刺激下的活化。纳米颗粒为 miRNA 递送提供了一个有前景的平台，它们能够精确靶向肿瘤部位、穿过 BBB 并穿透肿瘤血管，使其特别适用于 HGG 治疗。将载有 miRNA 的纳米颗粒纳入 NK 细胞疗法是一个具有巨大潜力的新兴领域。例如，携带 miR-186 的 NK 细胞衍生外泌体已证明可通过阻止 TGF-β1 介导的 NK 细胞抑制对 MYCN 扩增的神经母细胞瘤产生细胞毒作用。这些发现强调了载 miR-186 的纳米颗粒作为增强 NK 细胞介导的免疫疗法的治疗策略的潜力。

此外，开发 CAR-NK 细胞（通过基因改造可识别 GSC 上表达的特定抗原，例如 EGFRvIII 和 GD2）代表了一种具有巨大治疗潜力的尖端策略。EGFRvIII是一种肿瘤特异性抗原，由EGFR基因中某些外显子的框内缺失产生，它通过组成性激活促进肿瘤生长，同时在正常组织中不存在，这使其成为理想的靶点。研究表明，使用 NK-92 细胞靶向 EGFR 和 EGFRvIII 的双特异性 CAR-NK 细胞可有效抑制肿瘤生长并延长颅内 GBM 异种移植小鼠的生存期。此外，经过基因改造以过表达趋化因子受体 CXCR4 的 EGFRvIII 特异性 CAR-NK 细胞表现出对 CXCL12 / SDF-1α 分泌 GBM 细胞的增强趋化性，使一些小鼠的肿瘤完全缓解，并且与对照组相比生存期显著提高。神经节苷脂 GD2 是一种糖脂，在多种肿瘤中高表达，包括胶质母细胞瘤 (GBM) 和 DIPG，但在正常组织中表达有限，是另一个有希望的靶点。已知胶质母细胞瘤 (GBM) 中的胶质母细胞瘤干细胞 (GSC) 过表达 GD2，GD2通过促进细胞增殖、迁移和免疫逃避在肿瘤进展中发挥作用。GD2 特异性 CAR-NK 细胞已证明能够在体外和体内患者来源的细胞模型中有效杀伤 GD2 高表达的 DIPG 细胞。

溶瘤病毒可以重塑肿瘤微环境 (TME)，从而增强 NK 细胞活性。通过直接靶向肿瘤细胞并触发抗肿瘤免疫反应，经基因工程改造以表达 IL-15/IL-15Rα 复合物的病毒已被证明可以显著增强 EGFR-CAR NK 细胞对抗胶质母细胞瘤 (GBM) 的疗效。此外，研究报告称，自噬抑制剂和干扰素基因激动剂具有修饰 TME 的能力，从而进一步增强 GBM 中 NK 细胞介导的抗肿瘤免疫反应。靶向 galectin-1（一种在 GBM 细胞中过表达的 β-半乳糖苷结合凝集素），可诱导含有 miRNA-1983 的外泌体释放到 TME 中。这些外泌体与浆细胞样树突状细胞 (DC) 和常规 DC 上的 Toll 样受体 7 (TLR7) 结合，激活 TLR7 并触发 IFN-β 的释放，从而增强 NK 细胞介导的针对 GBM 细胞的细胞毒性。另一种有前景的方法是针对 αv 整合素/TGF-β 轴，这已显示出改善过继转移的 NK 细胞在攻击 GSC 中的浸润和功能的潜力。基于细胞因子的疗法，包括 IL- 2和IL -15，已被用于促进 NK 细胞增殖和活化。免疫细胞因子是与细胞因子结合的单克隆抗体，代表了另一种增强 NK 细胞活性的创新方法。在临床前胶质母细胞瘤 (GBM) 模型中，与细胞因子 IL-2 连接的 L19 抗体疗法与放射疗法联合使用，成功增强了 NK 细胞浸润，促进了肿瘤消退并提高了生存率。此外，靶向募集免疫抑制性 MDSC 和肿瘤相关巨噬细胞，或可改善 HGG 中的 NK 细胞浸润和功能。表3 概述了其他提高 NK 细胞抗 HGG 疗效的策略。

表3 增强 NK 细胞治疗 HGG 的临床前策略

表4 重点介绍了近期部分采用 NK 细胞疗法治疗 GBM 患者的临床试验。一项 1/2a 期临床试验（该研究已在 ClinicalTrials.gov 注册：KCT0003815）评估了复发性 GBM 患者外周血单个核细胞来源的过继、离体扩增和激活的 NK 细胞和 T 淋巴细胞的安全性和有效性。结果显示，中位总生存期为 22.5 个月，中位无进展生存期为 10 个月。值得注意的是，五名患者表现出持久反应，存活超过 2 年，免疫反应转录组特征增强，在完成治疗后的最后一次随访中没有临床衰退的迹象。此外，一项 1 期试验（该研究已在 ClinicalTrials.gov 注册：NCT01588769）研究了针对 GBM 患者的肿瘤细胞的自体淋巴效应细胞的耐受性和有效性。用 DNA 去甲基化剂处理的活化 CD4 + T 辅助细胞被诱导表达广谱内源性癌症/睾丸抗原，使它们能够充当抗原呈递细胞并促进自体细胞毒性 T 淋巴细胞和 NK 细胞的生成。三名患者观察到肿瘤消退，反应持续长达 27 个月，并且未报告与治疗相关的不良事件。此外，正在进行的临床试验正在积极探索基于 NK 细胞的 HGG 疗法。例如，NCT03383978正在评估复发性 HER2 + GBM患者颅内注射 NK-92/5.28.z CAR NK 细胞联合静脉注射 ezabenlimab 的效果。II 期试验NCT06687681正在研究对新诊断的 3 级或 4 级脑肿瘤（包括 GBM 和 DIPG）患者鞘内注射活性同种异体 NK 细胞。患者将通过腰椎穿刺接受活性NK细胞注射。此外，1期临床试验NCT04991870旨在确定TGF-βR2和NR3C1缺失的工程化NK细胞（CB-NK-TGF-βR2−/NR3C1−）在治疗复发性胶质母细胞瘤（GBM）中的最佳剂量、获益和副作用。本研究重点评估在这些患者中递增剂量的现成CB-NK-TGF-βR2 − /NR3C1 −的安全性和耐受性。这些多样化的策略体现了我们为优化HGG的NK细胞疗法所做的全面努力，为开发更有效、更持久的治疗方案来对抗这些侵袭性强且致命的脑癌带来了希望。

表4 基于NK细胞的胶质母细胞瘤（GBM）疗法的临床试验

讨论和未来展望

HGG 是最致命的癌症之一，其中成人胶质母细胞瘤 (GBM) 和儿童弥漫性胶质母细胞瘤 (DIPG) 的侵袭性尤为突出。尽管这些肿瘤影响不同的患者群体和脑区，但它们具有一些关键特征：对标准治疗具有耐药性、侵袭性高、预后不良，以及存在促肿瘤进展和复发的生殖干细胞 (GSC)。

尽管NK细胞疗法取得了进展，但治疗高胶质母细胞瘤（HGG）仍面临重大挑战。自体和同种异体原代NK细胞的寿命有限，输注后难以存活，其浸润实体肿瘤的能力受到肿瘤微环境中（TME）的物理屏障（例如血脑屏障和细胞外基质）的阻碍。随着肿瘤进展，NK细胞的靶向效力逐渐减弱。NK细胞系提供了可扩展的现成治疗方案，但它们难以操控或改造以增强疗效。虽然CAR-NK细胞和NKCEs靶向性更精准，但它们在HGG的TME中仍然面临物理屏障、持久性差和半衰期短等问题。NK细胞衍生的外泌体被认为是下一代疗法，由于其体积更小，更容易跨越物理屏障，有望突破这些屏障。然而，具有免疫抑制性的TME持续削弱其疗效。鉴于这些局限性，探索新的方法来增强NK细胞对HGG的治疗至关重要。我们提出了改进和临床推进这些疗法的三个关键方向：

（1）促进 NK 细胞运输和浸润至 HGG。血脑屏障 (BBB) 是 NK 细胞以及全身给药的 NKCE 的重大障碍，限制了它们进入肿瘤。暂时破坏血脑屏障 (BBB) 可以改善 NK 细胞和 NKCE 的输送，聚焦超声等方法通过在 BBB 中制造短暂开口显示出良好的前景。另一种方法是调节趋化因子以增强 NK 细胞运输。例如，过表达 CXCL10 等趋化因子（其与 NK 细胞上的 CXCR3 结合）可以改善 NK 细胞归巢至 HGG。放射疗法也可能增加肿瘤微环境中趋化因子的表达并破坏物理屏障，使 NK 细胞更容易接近肿瘤。肿瘤治疗场 (TTFields) 于2011年获得美国食品药品监督管理局批准用于治疗胶质母细胞瘤 (GBM)，它可以激活肿瘤内的 IFN 信号传导。这种激活可能会增强 NK 细胞归巢至 HGG，并提高其靶向和消除 GSC 的能力。此外，从全身到局部输送 NK 细胞可显著改善浸润。将 NK 细胞注射到脑室内或直接注射到肿瘤内可绕过 BBB，从而提高肿瘤部位的 NK 细胞浓度并增强治疗效果。此外，使用可穿透 BBB 的 NK 细胞外泌体可以更好地进入肿瘤。NK 细胞外泌体通过携带穿孔素和颗粒酶保留了细胞毒特性，可以靶向 HGG 中的 GSC，而无需直接 NK 细胞浸润。例如，考虑到 miRNA-1983 在 GBM 治疗中的治疗潜力，开发负载 miRNA-1983 的 NK细胞衍生外泌体可能是靶向 HGG TME 内的 GSC 的一种有前途的方法。

（2）增强 NK 细胞的持久性和功效。CRISPR-Cas9 等精密工程工具可以通过删除与 NK 细胞耗竭或抑制途径相关的基因来增强免疫抑制性肿瘤微环境中的 NK 细胞活性。将 NK 细胞与 IgG 抗体结合可增强 ADCC 效应，从而增强 NK 细胞杀伤功效。通过靶向TGF - β 等免疫抑制信号或重编程肿瘤相关巨噬细胞和 MDSC来调节肿瘤微环境本身，也可以增强 NK 细胞的存活和功能。另一种有前景的方法是将基于 NK 细胞的疗法与其他疗法相结合，例如放疗、化疗、TTFields、溶瘤病毒、免疫检查点抗体（例如 PD-1/PD-L1、CTLA-4 抗体）或细胞因子（例如 IL-12、IL-15）。例如，放疗和化疗（如 TMZ，GBM 的标准治疗方法）可诱导 GSC 上应激配体（如 MICA/B 和 ULBPs）的上调，而这些应激配体可被 NK 细胞上的激活受体 NKG2D 识别。此外，放疗和化疗的免疫调节作用可改善 NK 细胞在 TME 内的浸润和持久性，从而增强其直接的细胞毒作用。某些化疗药物还通过消耗免疫抑制细胞（包括 MDSC 和 Tregs）来降低 TME 的免疫抑制性质，从而进一步增强 NK 细胞的功能。溶瘤病毒选择性地感染肿瘤细胞并在其中复制，释放趋化因子（如 CXCL10），募集 NK 细胞至 TME。它们还能增强肿瘤细胞上应激配体的表达，促进 NK 细胞识别，诱导免疫原性细胞死亡，从而激活树突状细胞 (DC) 并促进 TME 内的 NK 细胞活化。免疫检查点，包括 PD-1/PD-L1、TIGIT/CD96/CD155 和 LAG- 3 /TIM-3，在抑制 HGG TME 中的 NK 细胞活性方面发挥着重要作用。通过免疫检查点阻断来靶向这些检查点（单独或组合）提供了一种恢复NK 细胞功能并增强其对 GSC 的细胞毒性的有前景的策略。

（3）加强 NK 细胞疗法的临床转化。从临床前成功到可扩展、可靠的 HGG 患者疗法的转变面临诸多挑战，包括监管、生产和物流方面的障碍。建立强大的 NK 细胞疗法生产平台并确保其可扩展性对于其临床应用至关重要。通过克服这些挑战，我们可以促进在临床环境中更广泛地应用有效的 NK 细胞 HGG 治疗。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所资助，资助编号为 P30CA030199。