2025年3月27日 发表于 Oncotarget
摘要
胶质母细胞瘤仍然是一种致命的成人脑肿瘤，治疗选择有限。TIC10/ONC201 是我们发现的首创的咪唑啉，在患有 H3K27M 突变的弥漫性胶质瘤 (DG) 患者的 I/II 期试验中取得了有意义的治疗效果，目前该药物正在进行随机 III 期测试（ACTION 试验；NCT05580562）。ONC201 靶向线粒体蛋白酶 ClpP，以破坏氧化磷酸化并触发综合应激反应 (ISR)、TRAIL/DR5 和肿瘤细胞死亡。虽然 ONC201 及其类似物 ONC206 正在作为单一药物进行临床试验，但关于它们与常规治疗相互作用的信息有限。我们表明 ONC201 和 ONC206 与替莫唑胺 (TMZ) 和放射疗法 (RT) 有协同作用。 ONC201 增强 TMZ 或 RT 诱导的细胞凋亡、ISR 和细胞毒性。ClpP 沉默可抑制 ONC201 诱导的细胞毒性，但不能抑制 TMZ。在用咪唑啉酮 + TMZ 治疗后，ONC201 和 ONC206 均可降低 H3K27M 突变 DG 细胞中观察到的 TMZ 抗性介质 MGMT 的表达。细胞因子分析表明 ONC201 相对于 TMZ 治疗具有不同的效果。这些结果表明 ONC201 抗肿瘤活性的潜在机制与 TMZ 或 RT 相关的机制不同，这三种治疗方法之间可能存在协同作用。三联 ONC201+RT+TMZ (IRT) 疗法将原位 U251 GBM 模型中的中位生存期延长至 123 天，且生存曲线上有尾部（7 只小鼠中有 3 只存活超过 200 天），而 ONC201（44 天；p=0.000197）、RT（63天；p=0.0012）、TMZ（78天；p=0.0354）、ONC201+RT（55 天；p=0.0004）、ONC201+TMZ（80 天；p=0.0041）和 RT+TMZ（103天；p>0.05）的存活期均低于 IRT 疗法。到 231 天时，唯一存活的小鼠是 IRT 组小鼠。我们的结果支持研究 ONC201/ONC206 与 RT/TMZ（IRT）联合用于 GBM 或 H3K27M 突变 DG 治疗。
介绍
中枢神经系统肿瘤是儿童和成人中最致命的癌症之一。仅在美国，每年就有超过 13,000 例新诊断的恶性脑肿瘤病例。胶质母细胞瘤 (GBM) 是成人中枢神经系统最常见、生长迅速且侵袭性最强的原发性恶性肿瘤，预后不良，中位生存期不到 15 个月，仅 10% 的患者对标准治疗有反应。GBM 是一种快速生长且侵袭性的脑肿瘤，占恶性神经胶质瘤的 ~60–70% 和中枢神经系统肿瘤的 ~15%。此外，弥漫性内在性桥脑神经胶质瘤 (DIPG) 是另一种致命的儿童脑干肿瘤，主要与 H3K27M 突变有关，其 5 年生存率极低，不足 1%，主要与 H3K27M 突变有关。 GBM 的标准治疗 (SOC) 是最大限度安全的手术切除，然后同时进行放射治疗 (RT) 和替莫唑胺 (TMZ) 治疗 6 周，然后辅助 TMZ 治疗 6 个月，但总体生存率 (OS) 仍然相对较低。放射治疗是 DIPG 的主要治疗方式，但鉴于更高的全身毒性，同时使用替莫唑胺的益处值得怀疑，而化疗是先给婴儿提供，以推迟放射治疗，直到他们的大脑发育得更好。
TMZ 是一种烷化剂，通过甲基化单链 DNA 上的腺嘌呤和鸟嘌呤残基发挥治疗作用。O-6-甲基鸟嘌呤（O-6-MeG）甲基化后若未修复，会与胸腺嘧啶错误配对，从而引发错配修复 (MMR) 。如果单链或双链 DNA 断裂且未修复，最终会导致生长停滞或细胞凋亡。O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶 (MGMT)（一种参与 DNA 修复的酶）的存在或缺失会降低或增强 TMZ 对该酶启动子未甲基化和甲基化的肿瘤的疗效。MGMT 启动子甲基化可抑制 MGMT 蛋白表达，与接受放射和替莫唑胺治疗的未甲基化的 GBM 相比，其 OS 明显更长。
ONC201（也称为 TIC10，最初由 El-Deiry 实验室发现，是一种 TRAIL 诱导化合物），是一种新型的首创小分子咪唑酮化合物，在靶向参与癌症进展的各种途径方面显示出良好的前景，例如外在凋亡途径、促凋亡 TRAIL 受体 DR5 的上调。最初发现 ONC201 可灭活 ERK/AKT，从而导致 Foxo3a 核易位和 TRAIL 基因活化。后来发现 ONC201 可激活综合应激反应 (ISR)，导致 ATF4 依赖的 TRAIL 受体 DR5 上调。其他研究已证实癌症干细胞的消耗和自然杀伤细胞介导的免疫反应的激活，而 TRAIL/DR5 是宿主抗癌先天免疫反应的一个组成部分。最近的研究表明，ONC201 及其咪唑啉酮类似物 ONC206 和 ONC212 作为激动剂与线粒体 ClpP 结合，抑制氧化磷酸化作为其抗癌机制的一个组成部分，最终导致细胞凋亡。此外，ONC201 及其类似物对 DIPG 细胞系表现出有效性，并能穿过血脑肿瘤屏障，表明它们在临床上可用于治疗中枢神经系统肿瘤。
Imipridones ONC201 的临床研究和同情用药案例凸显了其良好的疗效，尤其是在 H3K27M 突变肿瘤（包括 DIPG 和 GBM）中。当前正在试验探索 ONC201 及其类似物与标准疗法的结合，以期增强其在这些侵袭性肿瘤中的治疗潜力。重要的是，ONC201 目前正在针对患有各种实体瘤的患者进行临床研究，并在复发性 H3K27M 突变弥漫性神经胶质瘤患者中进行一项随机 III 期研究（ACTION试验；NCT05580562）。ONC206 目前正在针对新诊断或复发性弥漫性中线神经胶质瘤的儿童和年轻人进行两项 1 期研究（NCT04541082、NCT04732065）。值得注意的是，在 ONC201 最近的同情用药案例中，不同脑肿瘤（尤其是 DIPG、胶质母细胞瘤和其他高级中线脑肿瘤）中 H3K27M 突变的患者表现出了良好的效果，包括肿瘤显著缩小和临床改善。此外，ONC201 及其类似物可触发 ISR，这可能会减弱 DNA 损伤修复蛋白的表达，这可能会增强放射和同时使用 TMZ 对 MGMT 未甲基化 GBM 的影响。ONC201 在 H3K27M 突变型儿童 DIPG 中的临床经验为使用 TMZ 联合 RT 治疗以研究 GBM 和 DIPG 细胞、体内模型和患者中的协同作用提供了进一步的理由。
我们研究了 Imipridones ONC201 与 RT 和 TMZ (IRT) 联合作为针对 GBM 的三联疗法的协同作用。通过对各种脑肿瘤细胞系（包括 GBM、DIPG 和非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤）进行体外和体内实验，我们评估了细胞活力、ISR 活性和细胞凋亡。来自体内原位 GBM 小鼠研究的结果表明，与单一或双重疗法相比，三联疗法显著延长了生存期并减少了肿瘤负担，减少了细胞增殖并诱导了更多的细胞凋亡，这表明三联疗法是 GBM 一线治疗的一种有希望的途径。我们扩展了研究并显示了 IRT 联合疗法中 ONC206 的类似效果。重要的是，我们观察到 Imipridones ONC201 和 ONC206 在胶质瘤细胞系中具有独特的细胞因子谱和对 MGMT 表达的抑制，这是与 TMZ 的潜在协同机制。在用 ONC201 或 ONC206 联合或不联合 TMZ 治疗后，在 H3K27M 突变的 DIPG 细胞系中观察到 MGMT 蛋白的抑制。总体而言，我们的临床前研究结果支持进一步探索 ONC201 和 ONC206 IRT 方案作为治疗 H3K27M 突变的 GBM 和弥漫性胶质瘤的潜在方法。
结果
Imipridones ONC201 与 RT 的联合使用可产生协同作用，导致 GBM 细胞系细胞活力丧失
此前，体外实验证实了Imipridones ONC201 的单药细胞毒性或与放射治疗或替莫唑胺联合治疗的细胞毒性。因此，我们推测 ONC201 可能与放射治疗和替莫唑胺在恶性脑肿瘤治疗中发挥协同作用。为了验证这一假设，我们利用细胞活力或菌落形成试验对胶质母细胞瘤 (GBM: SNB19、T98G 和 U251)、弥漫性内在性脑桥神经胶质瘤 (DIPG: SF8628) 和非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤 (ATRT: BT-12、BT-16) 细胞系进行了测试，ONC201 单独剂量高达 20 μM 或与放射治疗剂量高达 8 Gy 或替莫唑胺联合剂量高达 100 μM。我们采用Western印迹分析来记录单一或联合治疗药物诱导的细胞凋亡，结果显示ONC201与RT之间以及ONC201与TMZ之间具有协同作用，最佳组合指数分别为0.51和0.21。
我们后来研究了 ONC201 和 RT 的组合是否产生了与之前报道的类似的协同作用。为了研究 ONC201 与 RT 联合对脑肿瘤细胞系的协同活性，我们用不同剂量的 TRAIL 通路诱导剂 ONC201 和 RT 处理了一组人脑肿瘤细胞系，包括 GBM 细胞系 SNB19、T98G 和 U251，以及非典型畸胎瘤样横纹肌瘤 (ATRT) 细胞系 BT-12 和 BT-16。治疗后的细胞活力证明，在所有测试的细胞系中，不同剂量组合的 ONC201 和 RT 之间都存在协同作用（图1A）。协同作用最高的细胞系是 GBM 细胞系 SNB19、T98G 和 U251 细胞以及 ATRT BT12 细胞系。
图1. ONC201 与 RT 产生协同作用。
(A) ONC201 与放射治疗相结合治疗的 GBM 细胞系 SNB19、T98G 和 U251，以及非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤 (ATRT: BT-12、BT-16) 细胞系显示出对细胞活力的治疗效果。(B) ONC201 单独使用高达 4 μM 或与高达 8 Gy 的放射治疗相结合进行集落形成试验。蓝色框是显示 ONC201 和放射治疗之间协同作用的剂量组合。Combenefit 用于评估多种治疗对短期细胞活力和长期集落形成试验的相互作用 - 协同组合用大于零的协同作用分数表示。 （C）利用蛋白质印迹法评估治疗后的脑肿瘤细胞中 PKA 底物磷酸化的诱导、ATF4 作为 ISR 激活标志物的诱导、以及多种细胞死亡标志物（如裂解的 PARP 和裂解的 Caspase 3）。
ONC201 与 RT 的结合可协同抑制 GBM 细胞系的集落形成
在短期细胞活力测定中观察到 GBM 和 ATRT 细胞系之间的协同细胞毒性后，我们探索了在长期暴露下是否可以观察到类似的敏感性和协同作用。进行了 7 天的菌落形成试验，以评估 ONC201 单独使用（高达 4 μM）或与 RT 联合使用（高达8Gy）的效果（图1B）。在 ONC201 和辐射暴露下发现，BT16 的 LD90 为 2 μM 和 4 Gy，SNB19 为 2 μM 和 6 Gy，U251 为 1 μM 和 4 Gy（图1B）。与单一药物治疗相比，联合使用 ONC201 和 RT 治疗后，BT16 的菌落形成能力降低最敏感，其次是 U251，然后是 SNB19（图1B）。因此，图 1B中的长期菌落形成试验表明，当 ONC201 与 RT 结合治疗 GBM 和 ATRT 细胞时，具有强大的抗癌作用。
ONC201 和 RT 激活 ISR，增强 PARP 和 caspase 裂解和细胞凋亡
在所有测试的 GBM 细胞系中观察到高度的协同作用后，我们探索了 ONC201 和 RT 治疗是否会诱导细胞凋亡。T98G、SNB19 和 U251 胶质瘤细胞系暴露于不同剂量的 ONC201 和 RT。Western 印迹分析显示，ONC201 剂量依赖性地增加 ATF4 蛋白的表达和活化水平，ATF4 蛋白是 ISR 的介质和 ISR 活化的标志物，可能通过特定的 eIF2 α 激酶实现，如前所述。在 5 μM 的较高 ONC201 剂量水平下也观察到 PKA 底物磷酸化增加。包括裂解的 PARP 和裂解的 caspase 3 在内的细胞凋亡标志物被诱导，并在 5 μM ONC201 和 8 Gy RT 下达到最高水平（图1C）。总体而言，图1C中呈现的数据支持 ONC201 与放射疗法在 GBM 细胞系中具有协同作用的结论。
Imipridones ONC201 与替莫唑胺协同作用对抗 GBM 和 DIPG 细胞系
观察到 ONC201 和 TMZ 单药治疗的细胞毒性后，我们进一步研究了 ONC201 和 TMZ 的组合是否产生协同作用。我们进行了细胞活力和菌落形成试验，以评估 ONC201 和 TMZ 与弥漫性内在性脑桥神经胶质瘤 (DIPG) 细胞系 SF8628 和 SU-DIPG-IV 以及 GBM 细胞系 U251 的组合，使用两种药物的联合浓度增加。如图2A所示，在所有测试的 TMZ 浓度和高达 5 μM 的 ONC201 的细胞活力测定中，联合指数 (CI) <1，SU-DIPG-IV 具有很强的协同作用 CI=0.26。在菌落形成试验中也观察到了类似的协同作用，5 μM ONC201 和 200 μM TMZ 的组合对 U251 和 SF8628 具有较强的协同作用。（图2B）。
(A) 用 ONC201 和 TMZ 联合治疗的弥漫性内在性脑桥神经胶质瘤 (DIPG) 细胞系 SF8628 的细胞活力测定。进行 CellTiter Glo 测定以确定治疗后的细胞活力。使用 CompuSyn 软件，通过 Chou 和 Talalay 的方法计算组合指数 (CI)。方框中突出显示的是显示协同作用的剂量组合。数据显示 ONC201 高达 5 μM 和 TMZ 高达 400 μM 之间存在协同作用。(B) 进行集落形成测定以确定治疗后的长期细胞活力。Combenefit 用于评估两种治疗对集落形成测定的相互作用 - 协同组合用协同得分大于零表示。数据显示 5 μM ONC201 和 200 μM TMZ 之间的协同作用最强。 (C) 使用蛋白质印迹法评估在治疗的脑肿瘤细胞中 ATF4 和 CHOP 作为 ISR 激活标志物的诱导作用，以及裂解 PARP 作为细胞死亡标志物的诱导作用。图2C中的上样对照来自图 3D中 0 Gy 条件下的相同实验和相同凝胶。数据证明 ONC201 和 TMZ 之间存在协同作用。(D) ONC201 诱导的线粒体功能障碍反映在 SU-DIPG 36 细胞系中最大细胞呼吸作用的降低。治疗条件以不同的颜色显示。(E) 使用 ONC201 或 TMZ 单药治疗或 ONC201 与 TMZ 联合双药治疗，测试 ONC201 对 SU-DIPG 36 细胞系中耗氧率 (OCR) 的影响。使用 Seahorse Analyzer 测量治疗后细胞的 OCR。处理条件如图 D 所示。（F）siRNA 敲低 GBM 细胞系 U251 中的 ClpP 表明 ONC201 诱导的细胞毒性依赖于 ClpP，而 siRNA 敲低 ClpP 对 TMZ 诱导的细胞毒性没有影响。
Imipridones ONC201 与 TMZ 联合使用可诱导 GBM 细胞中的 ISR
在观察到 GBM 细胞系中存在显著的细胞毒性协同作用后，我们研究了 ONC201 和 TMZ 处理后 ISR 的潜在激活情况。Western blot 分析表明，在用 ONC201 和/或 TMZ 处理后，ATF4 和 CHOP（ISR 激活的标志物和凋亡途径的诱导物）上调（图2C、3D、4）。当用 2.5 uM ONC201 和 60 uM TMZ 处理 T98G 和 U138 时观察到对 ATF4 诱导的强大协同作用 - 联合治疗时出现明显的 ATF4 谱带，而单独治疗时均未出现 ATF4 谱带。这些发现表明 ISR 激活在 ONC201 和 TMZ 的协同作用中起着重要作用。
图3. ONC201与RT和TMZ的IRT三重组合在脑肿瘤细胞中产生协同作用。
(A) 使用细胞活力评估了 ONC201、RT 和 TMZ 的 IRT 三重组合处理的 BT16 细胞。显示了以不同辐射剂量处理的横纹肌样瘤细胞系 BT16 的组合指数，TMZ 和 ONC201 如图所示。(B) 显示了以 ONC201 单独处理或与 TMZ 组合处理的 GBM U251 细胞的集落形成试验，每种药物的浓度均如此。(C) IRT 三重组合治疗后 GBM U251 细胞集落形成的量化。使用 CompuSyn 软件计算组合指数 (CI)，25 μM TMZ 和 1.25 μM ONC201 之间的最低 CI 为 0.34。 (D) 蛋白质印迹法评估 ATF4 和 CHOP 作为 ISR 激活标志物的诱导作用、裂解 PARP 作为细胞死亡标志物的抑制作用以及 Rad51（一种选择性 DNA 修复靶标，用于放射增敏治疗的 GBM U251 细胞中的胶质瘤干细胞）的抑制作用。数据表明，与 ONC201、RT 和 TMZ 的 IRT 疗法具有协同作用。
图4. ONC201、TMZ 和 RT 的 IRT 三重组合显示出强大的协同作用，诱导 ATF 作为 ISR 激活的标志，并抑制 ClpX 在 SNB19、T98G、U138 和 U251 GBM 细胞中释放 ClpP。
通过蛋白质印迹法评估了 IRT 与 ONC201、RT 和 TMZ 联合治疗对 BT16、SNB19 和 U251 GBM 细胞系的影响。IR 联合治疗可诱导 ATF4 并抑制 ClpX。微管相关蛋白轻链 3 (LC3) 用作监测自噬的特定标记物，治疗后没有出现显著变化。在 37 °C下，用 ONC201、TMZ 和 RT 以指示的药物浓度或辐射剂量处理细胞48 小时。
Imipridones ONC201 激活 ClpP 会损害氧化磷酸化，并在呼吸链复合物亚基还原后诱导细胞凋亡
基于 ONC201 和 TMZ 治疗后 ISR 激活和诱导细胞凋亡的发现，我们随后评估了线粒体蛋白酶 ClpP（酪蛋白水解线粒体基质肽酶蛋白水解亚基，可降解受损或错误折叠的蛋白质），这是最近描述的 ONC201 的结合和激活靶点，对 ONC201 和 TMZ 治疗后 SU-DIPG-36 细胞系中氧化磷酸化和线粒体功能的相关性。我们的数据表明，用 ONC201 或 ONC201 与 TMZ 联合治疗会导致基础和最大耗氧率降低，并且 ONC201 诱导的线粒体功能障碍反映在 SU-DIPG-36 细胞系中最大呼吸作用的降低和备用呼吸能力的降低（图2D）。值得注意的是，单独使用 TMZ 对该细胞系的最大耗氧率没有影响（图2D、2E）。
Imipridones ONC201 诱导的细胞毒性依赖于 ClpP，而 TMZ 诱导的细胞毒性不依赖于 ClpP
为了进一步阐明 ONC201 联合或不联合 TMZ 导致最大呼吸量下降和呼吸能力下降的机制，我们研究了 GBM 细胞系 U251 中线粒体蛋白酶 ClpP 的依赖性。使用对照和 ClpP siRNA 进行 RNA 干扰研究，将对照和 ClpP siRNA 引入 U251 细胞，然后分别以 0 至 16 μM 和 0 至 1.6 mM 浓度的 ONC201 和 TMZ 进行处理。如预期的那样，siClpP 保护细胞在 ONC201 后免于丧失活力，但在 TMZ 处理后则没有效果（图2F）。结果证实线粒体蛋白酶 ClpP 是 ONC201 的激活靶点，并表明 ONC201 诱导的细胞死亡可能是由线粒体功能障碍介导的。相比之下，替莫唑胺诱导的细胞毒性并不依赖于 ClpP。
ONC201 与 RT 和 TMZ 协同作用，作为脑肿瘤细胞的 IRT 联合疗法
我们假设 ONC201 可能在脑肿瘤中与 TMZ 或 RT 产生协同作用。为了验证这一假设，我们使用细胞活力、菌落形成和蛋白质印迹试验评估了 ONC201、RT 和 TMZ 的组合（称为 ONC201 IRT 疗法）与 ATRT 细胞系 BT16 和 GBM 细胞系 U251 的效果。进行了 CellTiter Glo 和菌落形成试验以确定使用 ONC201、RT 和 TMZ 的 IRT 组合治疗后的细胞毒性作用，结果发现三重组合在抑制 BT-16 细胞活力（图3A）和抑制 U251 菌落形成（图3B、3C ）方面发挥了强大的协同作用。总的来说，在脑肿瘤细胞中，ONC201 在细胞活力（图3A）和菌落形成试验（图3B、3C）方面与 TMZ 和 RT 产生协同作用。
使用蛋白质印迹分析来评估处理后的细胞凋亡，结果显示 ATF4 诱导作为 ISR 激活的标志，PARP 裂解作为细胞死亡的标志，ATPase Rad51 受到抑制，ATPase Rad51 是一种选择性 DNA 修复靶点，可使脑肿瘤细胞中的胶质瘤干细胞对放射敏感。Rad51 抑制可去除表达 SOX2 的细胞并消除克隆形成性（图 3D）。2.5uM ONC201 单一药物治疗可在 GBM 细胞系 U251 中诱导 ATF4。添加 200 uM TMZ 和 6 Gy RT 可增加 ATF4 诱导。GBM 细胞系 U251 在单独使用 TMZ 处理后显示 Rad51 表达增加。Rad51 水平与放射敏感性呈负相关。ONC201 暴露后 Rad51 的下调显着增加了 TMZ 和 RT 的细胞毒性。这些数据证明了 ONC201、TMZ 和 RT 之间的协同作用，这种协同作用是诱导 ISR、抑制同源重组 (HR) 和随后的放射增敏的结果。
ONC201、RT 和 TMZ 的 IRT 三重组合在 SNB19、T98G、U138 和 U251 GBM 细胞系中表现出强大的协同作用，可诱导 ISR 和线粒体功能障碍
我们试图探索 IRT 三联疗法诱导 ISR 和凋亡的协同作用是否是其他 GBM 细胞系中的普遍现象。因此，我们将 ONC201、TMZ 和 RT 的组合应用于 SNB19、T98G、U138 和 U251 胶质母细胞瘤细胞，并对 PARP、ATF4、LC3B 和 ClpX 的表达进行蛋白质印迹分析（图4）。事实上，我们发现 ONC201 IRT 三联疗法诱导了 ATF4 并抑制了 ClpX，这表明在所有测试的 GBM 细胞系中 ISR 被激活并且 ClpP 最有可能被释放。此外，作为自噬特异性标记的微管相关蛋白轻链 3 (LC3) 在治疗过程中没有发生显著变化。总的来说，我们的生物标志物研究表明，IRT 三重组合治疗可诱导更多的 ISR 并抑制 ClpX 释放线粒体 ClpP（图4）。
ONC201 或 ONC206 IRT 疗法与 RT 和 TMZ 表现出协同作用，并具有不同的细胞因子谱
我们用 10 μM ONC201 或 1 μM ONC206 作为 IRT 疗法，结合 200 μM TMZ 和 2 或 10 Gy 辐射治疗 GBM 肿瘤细胞 (U251) 48 小时，随后使用 Luminex 200 技术分析细胞培养上清液 (图5)。发现在用 ONC201 或 ONC206 处理的 U251 细胞系中，与血管生成和/或 EMT 相关的几种细胞因子、趋化因子和生长因子下调。值得注意的是，血管生成素-1（一种对血管成熟、粘附、迁移和存活至关重要的强效血管生成生长因子）、M-CSF（一种调节单核细胞增殖、分化和功能激活的细胞因子）、β2-微球蛋白、PDL-1、IFN-γ R1、FAS、CCL2、CCL13 在接受 ONC201 联合 TMZ 和 RT 治疗后，在 2 和 10 Gy 辐射剂量下均有分泌减少。在接受 ONC206 联合 TMZ 和 RT 治疗后，在 2 和 10 Gy 辐射剂量下，这些细胞因子、趋化因子和生长因子也出现了类似但不那么明显的减少。同样，治疗后，与免疫抑制相关的几种细胞因子、趋化因子和生长因子（包括血管生成素-1、Fas 和可溶性 PD-L1）也下调。此外，ONC206 与 TMZ 和 RT 联合使用可诱导 TRAIL R3、CD40/TNFRSF5、CCL3/MIP-1a、IL-18/IL-1F4、GDF-15、CXCL5/ENA-78、IL-8/CXCL8、IL2、VEGF、血管生成素-2（一种促进细胞死亡并破坏血管形成的血管生成生长因子）和 TRAIL R2 的分泌，但 ONC201 不会。
图5.体外U251 GBM 细胞系中 ONC201 或 ONC206 与 RT 和 TMZ 的 IRT 三重组合 48 小时的差异细胞因子分析。
U251 肿瘤细胞用 ONC201 或 ONC206、TMZ 和 RT 在指定浓度或辐射剂量下处理 48 小时，然后用 Luminex 200 分析细胞培养上清液。显示倍数变化，其中红色表示正倍数变化，绿色表示负倍数变化。
两种抗癌细胞因子 MICA 和 IL-2 在联合治疗中持续增加。主要组织相容性复合体 (MHC) I 类肽 A MICA 是 NKG2D 的配体，NKG2D 是自然杀伤 (NK) 细胞上的受体。癌细胞脱落的 MICA 导致有效逃避 NKG2D 识别并导致癌症发展。可溶性 MICA 蛋白可以与 NK 细胞上的 NKG2D 结合并长期抑制它们。白细胞介素 2 (IL-2) 刺激肿瘤浸润性 NK 和 T 细胞的增殖和活化。
两种促癌细胞因子 M-CSF 和血管生成素-1 在联合治疗中显著降低。巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) 是一种在胶质母细胞瘤 (GBM) 组织和血清中升高的细胞因子。M-CSF 是巨噬细胞存活、增殖和分化的关键调节因子。它还在对肿瘤细胞的免疫反应中发挥作用。血管生成素-1 (Ang1) 是一种调节胶质母细胞瘤中肿瘤诱导的血管生成的生长因子。
ONC201 IRT 与 RT 和 TMZ 联合使用，是原位 GBM 小鼠的有效抗肿瘤药物
我们上述的细胞培养研究表明，在 GBM 细胞系 SNB19、T98G、U138 和 U251 以及 ATRT 细胞系 BT16 中，IRT 疗法与 ONC201 可与 RT 和 TMZ 产生协同作用。在细胞培养实验中，IRT 治疗细胞在 IRT 三联治疗方案后诱导 ATF4 和 CHOP 作为 ISR 激活的标志物，诱导 PARP 裂解或 caspase 3 裂解作为凋亡的标志物。接下来，我们试图探索在原位 GBM 小鼠模型中，在使用 ONC201 联合 TMZ 和 RT 治疗后，这种 IRT 三联治疗是否也能协同诱导 ISR 和凋亡。
使用 KOPF 940 型小动物立体定位框架和 Stoelting Quintessential 立体定位注射器向颅内注射表达荧光素酶的 U251 GBM 细胞，我们使用生物发光成像确认了肿瘤的形成和生长。本研究的结果证实，肿瘤在 ONC201 IRT 治疗开始前就在生长，这是通过基线和第 -3 天的肿瘤图像得出的（图6C）。小鼠随机接受每周一次的 ONC201（100 mg/kg 口服）和/或 TMZ（20 mg/kg 腹腔注射）和/或 RT（2 Gy 局部照射）治疗，为期两周，以进行短期生物标志物研究，或四周，以进行长期生存和肿瘤监测（表1和图6A）。在长期体内实验中，Kaplan Maier 生存曲线显示，在侵袭性人 GBM U251-Luc 细胞颅内异种移植中，为期四周的 IRT 三联疗法（ONC201 联合 TMZ 和 RT）可使小鼠的中位生存期延长至 123 天，而双药或单药治疗方案则无济于事（图6A）。与对照组相比，ONC201 与 TMZ 和 RT 协同作用可有效地使此类脑瘤小鼠的生存时间延长三倍，并且肿瘤体积减小（图6A、6B）。
图6. ONC201、RT 和 TMZ 的 IRT 三重组合治疗 4 周可显著延长小鼠生存期并减轻原位脑肿瘤模型中的肿瘤负担。
(A) 随机治疗组小鼠每周接受 ONC201（100 mg/kg 口服）和/或放射治疗（2 Gy 局部照射）和/或 TMZ（20 mg/kg 腹腔注射）治疗，持续四周，以进行长期生存和肿瘤监测。(B) 长期生存研究表明，与单一和双重治疗相比，ONC201、RT 和 TMZ 的 IRT 三重组合显著延长了生存期并减轻了肿瘤负担。(C) 肿瘤在开始治疗之前正在生长：基线和第 -3 天的肿瘤图像。 (D) 对 ONC201、放疗和 TMZ 的 IRT 三重组合治疗 2 周的 IHC 评估显示 Ki67 表达降低和裂解 caspase 3 诱导。(E) 短期生物标志物的量化表明 IRT 三重组合治疗可降低肿瘤细胞增殖（Ki67）并诱导更多细胞凋亡（裂解 caspase 3）。
因此，我们的长期生存研究表明，与单一治疗和双重治疗组合相比，ONC201、放疗和 TMZ 的 IRT 三联疗法可显著延长生存期并降低肿瘤负担。与 ONC201（44 天；p=0.000197）、IR（63 天；p=0.0012）、TMZ （78 天； p=0.0354）、ONC201 + IR（55 天； p=0.0004）相比，IRT 三联疗法可将中位生存期延长至 123 天，7 只小鼠中有 3 只存活超过 200 天。ONC201 + TMZ（80 天；p=0.0041）和 IR + TMZ（103 天；p>0.05）（补充图1）。到 231 天时，唯一幸存的小鼠属于 IRT 组。这些结果支持进一步开展更大规模的体内研究，考虑将 ONC201 或 ONC206 纳入目前胶质母细胞瘤的早期治疗标准，并表明三联疗法对 H3K27M 突变肿瘤具有潜在的协同作用，应在临床前和临床研究中进一步探索。
ONC201、RT 和 TMZ 的 IRT 三重组合治疗 2 周可抑制原位脑肿瘤模型中的增殖并诱导细胞凋亡
除了长期生存研究外，我们还试图探索在开始单药、双药或 IRT 三联疗法（ONC201、RT 和/或 TMZ）两周后从小鼠身上采集的肿瘤标本中的短期细胞增殖（Ki67）和凋亡标志物。短期生物标志物研究表明，使用 ONC201、TMZ 和 RT 的 IRT 三联疗法治疗两周可抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡，通过对治疗开始两周后收集的肿瘤标本分别进行 Ki67 和裂解胱天蛋白酶 3 测量来评估（图6D、6E）。因此，这些生物标志物研究表明，与单一治疗或双重治疗组合相比，IRT 三联治疗可减少肿瘤细胞增殖并诱导更多的细胞凋亡。
与ONC201 IRT 疗法相比，ONC206、RT 和 TMZ 的 IRT 三重联合疗法在体内抑制增殖和诱导细胞凋亡方面效果相似
鉴于 ONC206 已进入脑肿瘤患者的临床试验（NCT04732065、NCT04541082），我们试图收集初步数据，研究其与 TMZ 和 RT在体内协同作用的潜力，就像我们上文用 ONC201 所证明的那样。原位植入脑肿瘤细胞的小鼠（如图6所示）每周接受 ONC206（100 mg/kg 口服）和/或 TMZ（20 mg/kg 腹腔注射，每周一次）和/或 RT（2 Gy 局部照射）治疗，两周，以进行短期生物标志物研究。短期生物标志物研究（图7）表明，ONC206、TMZ 和 RT 的 IRT 三重组合治疗两周可减少肿瘤细胞增殖（Ki67）并诱导细胞凋亡（裂解的 Caspase 3）。这些结果与我们观察到的 ONC201、RT 和 TMZ 三重组合的结果相似，表明 ONC201 和 ONC206 这两种咪唑啉酮都值得与 TMZ 和 RT 联合在临床上进行进一步研究。
图7. ONC206 与 TMZ 和 RT 的 IRT 三重组合治疗两周可在体内原位 U251 GBM 模型中抑制增殖并诱导细胞凋亡。
一组三只小鼠每周接受 ONC206（100 mg/kg 口服）和/或放射治疗（2 Gy 局部照射）和/或 TMZ（20 mg/kg 腹腔注射）治疗，持续两周，以进行短期生物标志物研究。短期生物标志物研究表明，两周的 IRT 三重组合 ONC206、TMZ 和 RT 可降低肿瘤细胞增殖（Ki67）并诱导细胞凋亡（裂解 Caspase 3）。每组三只小鼠的量化结果如下。
使用 ONC201 或 ONC206（联合或不联合 TMZ）治疗后，H3K27M 突变的 DIPG 细胞系中 TMZ 抗性介质 MGMT 的表达降低
我们最近报告说，在我们常用的 GBM 细胞系中，MGMT 的表达较低，而在其他实体瘤细胞系中，MGMT 的表达相当高，并且 TMZ 可以在细胞分裂或突变发生前的几个小时内对 T 细胞杀死肿瘤细胞产生影响。MGMT 启动子甲基化导致 MGMT 蛋白表达缺失在 GBM 中很常见，并且与对 TMZ 的反应有关。相比之下，在 H3K27M 突变的弥漫性胶质瘤中，MGMT 启动子很少甚至从未甲基化，从而导致 TMZ 耐药性。我们假设，咪唑啉酮对 ISR 和整体蛋白质翻译抑制的影响可能会影响 MGMT 表达和与 TMZ联合治疗胶质瘤细胞时的潜在协同作用。由于我们的 GBM 细胞系（包括原位脑肿瘤实验中使用的 U251 细胞）的 MGMT 表达较低或无法检测到，因此我们选择测试咪唑吡啶单独使用或与 TMZ 联合使用治疗 DIPG 细胞时对 MGMT 表达的影响（图8）。我们发现证据表明 Imipridones（ONC201、ONC206 和 ONC212）会调节 DIPG 细胞系中的 MGMT 和 ClpX 表达。无论是在没有 TMZ 还是存在 TMZ 的情况下，ONC201 和 ONC206 均会降低 SF8628 细胞中的 MGMT 表达（图8A）。我们研究了咪唑吡啶对其他 DIPG 细胞系（包括 SU-DIPG-13、SU-DIPG-25、SU-DIPG-36 和 SU-DIPG-IV）中 ClpX 和 MGMT 的影响（图8B–8F）。我们发现，在单独使用 Imipridones 或与 TMZ 联合治疗的 DIPG 细胞系中，MGMT 蛋白表达有所降低。这些新发现表明，Imipridones 和 TMZ 之间存在潜在的协同作用机制，即抑制 MGMT 启动子通常未甲基化且对 TMZ 有抵抗力的 DIPG 细胞中的 MGMT 蛋白表达。
图8. Imipridones (ONC201、ONC206 和 ONC212) 调节 DIPG 细胞系中的 MGMT 和 ClpX 表达。
(A) ONC201 降低了 SF8628 细胞系中的 MGMT 表达。(B) ONC201 抑制了多种 DIPG 细胞系 (SU-DIPG-13、SU-DIPG-25、SU-DIPG-27 和 SU-DIPG-29) 中的 ClpX 表达。亚胺吡啶以剂量依赖性方式抑制 ClpX 表达，但不会降低 SU-DIPG-13 (C) 和 SU-DIPG-25 (D) 细胞系中的 MGMT。(E) 亚胺吡啶以剂量依赖性方式降低 SU-DIPG-IV 细胞系中的 ClpX 和 MGMT 表达。(F) 亚胺吡啶 (ONC201 和 ONC206) 抑制 SU-DIPG-36 和 SF8628 细胞系中的 ClpX 表达并降低 MGMT。
讨论
尽管采用了包括放射治疗和涉及 TMZ 的化疗在内的多模式疗法，但 GBM 的预后仍然不容乐观，综合治疗的中位生存期为 14.6 个月。此外，几项针对 EGFR、mTOR 和 VEGF 的药物的随机临床试验，以及多项疫苗研究和免疫检查点抑制剂，在对 GBM 进行有希望的早期 (I/II 期) 研究后，却得到了令人失望的结果。我们的体外和体内研究结果首次证明，将 ONC201 或 ONC206 与 TMZ 和 RT 相结合的 IRT 疗法可能是一种安全有效的 GBM 治疗策略。类似的三联疗法使用假定的 TRAIL 激动剂 TRA-8 与 TMZ 和 RT 相结合，也导致对胶质瘤干细胞的细胞毒性增强。他们的激酶组分析显示，这种增强的细胞毒性似乎是由抑制 JAK-STAT 和 Src 酪氨酸激酶信号传导介导的。我们发现了咪唑吡啶和 TMZ 协同作用的一种新机制，即抑制 MGMT 表达，这种机制可能是通过咪唑吡啶诱导的 ISR 抑制整体蛋白质翻译而实现的。我们的研究结果和 Arafat 等人的研究结果表明，TRAIL 是胶质母细胞瘤的重要肿瘤杀伤效应物。然而，我们的研究结果与 Arafat 等人的研究结果不同，因为我们首次通过不同于 TRAIL 受体激动剂的独特机制展示了咪唑吡啶治疗后对 MGMT 表达的影响。
我们从 IRT 三联治疗 GBM 细胞系的实验结果显示，IRT 三联治疗 ONC201 或其类似物 ONC206 与 TMZ 和 RT 相结合可显著抑制细胞存活、诱导更多细胞凋亡、破坏线粒体功能、抑制与血管生成和/或 EMT 相关的各种细胞因子、趋化因子和生长因子、免疫抑制或促进与细胞死亡相关的因素并破坏血管形成。此外，我们使用原位 U251 GBM 小鼠模型进行体内研究，该模型随机接受每周一次的 IRT 治疗 ONC201 或 ONC206 和/或放疗和/或 TMZ 治疗，持续四周，以进行长期存活和肿瘤监测，或两周，以进行短期生物标志物研究，结果表明，与长期研究中的单一和双重治疗组合相比，IRT 三联治疗可显著延长存活时间并减轻肿瘤负担。 IRT 三联疗法不仅可以减少肿瘤细胞增殖，还可以诱导更多细胞凋亡，并在短期生物标志物研究中抑制 ClpX 释放线粒体 ClpP。咪唑吡啶对多种 DIPG 细胞系中 MGMT 的影响提供了一种机制，即它们与 TMZ 的结合可以在临床上克服 TMZ 耐药性。这应该在包括 H3K27M 突变神经胶质瘤在内的肿瘤类型中进一步测试。
我们的研究表明，ONC201 与 RT 产生协同作用，诱导细胞凋亡，表现为产生多种细胞死亡标志物，如 PARP、裂解 PARP 和裂解 Caspase 3，诱导 PKA 底物磷酸化，上调 ATF4 作为治疗脑肿瘤细胞中 ISR 活化的标志物。
我们进一步研究了线粒体蛋白酶 ClpP（最近描述的 ONC201 结合靶点）对 DIPG 细胞氧化磷酸化和线粒体功能的相关性。我们的研究结果表明，ONC201 诱导的线粒体功能障碍反映在脑肿瘤细胞最大细胞呼吸作用的降低中。观察到的归因于 ONC201 的线粒体蛋白质降解和细胞毒性依赖于 ClpP，因为通过 siRNA 敲低 ClpP 可保护多种人类癌细胞系免受 ONC201 介导的细胞毒性。值得注意的是，替莫唑胺单独使用对基础耗氧率没有影响。我们证明，使用 ONC201、TMZ 和 RT 对 BT16 肿瘤细胞进行 IRT 三联治疗可诱导 ATF4（表明 ISR 激活）、裂解 PARP（作为细胞凋亡标志物）并抑制 RAD51（一种选择性 DNA 修复靶标，可使接受治疗的脑肿瘤中的胶质瘤干细胞放射增敏）。我们观察到，在 SNB19、T98G、U138 和 U251 GBM 细胞系中，IRT 三联治疗可诱导 PKA 底物磷酸化、诱导 ATF4/ISR 激活并抑制 ClpX 释放 ClpP，以及多种细胞死亡标志物。
使用 ONC201 或 ONC206 与 TMZ 和 RT 联合治疗 48 小时，对接受 IRT 治疗的 U251 GBM 细胞进行细胞因子分析。结果表明，使用 ONC201 和 ONC206 治疗后，与血管生成和/或 EMT 相关的几种细胞因子、趋化因子和生长因子均下调。同样，治疗后，与免疫抑制相关的几种细胞因子、趋化因子和生长因子均下调，包括血管生成素-1、Fas 和可溶性 PD-L1。有趣的是，ONC206 与 TMZ 和 RT 联合使用可诱导 TRAIL R3、CD40/TNFRSF5、CCL3/MIP-1a、IL-18/IL-1F4、GD-15、CXCL5/ENA-78、IL-8/CXCL8、IL2、VEGF、血管生成素-2 和 TRAIL R2 的分泌，而 ONC201 与 TMZ 和 RT 联合使用则不会。
长期生存研究表明，与单一治疗和双重治疗组合相比，IRT 三重组合 ONC201、放射疗法和 TMZ 可显著延长生存期并减少肿瘤负担。我们通过在基线和第 -3 天拍摄肿瘤图像，仔细记录了在开始 IRT 或其他治疗之前肿瘤的生长情况。对植入后第 130 天和第 161 天用指定药物或药物组合治疗的存活小鼠的肿瘤图像进行评估，结果表明 ONC201 与 TMZ 和 RT 协同作用，并且在人类 GBM U251 原位小鼠模型中比单一或双重治疗更能延长生存期。生物标志物研究表明，IRT 三重组合 ONC201、RT 和 TMZ 两周可抑制增殖并诱导肿瘤标本凋亡。生物标志物研究表明，IRT 三重组合治疗还抑制 ClpX 释放线粒体 ClpP。 ONC206 与 RT 和 TMZ 联合进行的短期体内IRT 治疗研究实现了相似的抗肿瘤效果，通过评估在体内原位 U251 GBM 模型中开始治疗两周后收集的肿瘤标本中的细胞增殖 (Ki67) 和细胞凋亡 (cleaved caspase 3) 标志物来评估。
根据我们的临床前细胞培养和体内数据，在原位胶质瘤小鼠模型中，ONC201 或 ONC206 的 IRT 三联疗法与 TMZ 和 RT 产生协同作用，迈出了临床转化的一步，并且这些研究提供了药效学生物标志物。
我们的研究结果首次证明 ONC201 或 ONC206 联合 RT 和 TMZ 的 IRT 疗法可能是一种安全有效的 GBM 治疗策略。未来的研究可能会揭示 ONC201 或 ONC206 加 TMZ 和 RT 治疗人源化和同基因免疫功能正常的GBM体内模型以及 GBM 患者后的新型信号传导机制。这包括 ISR、TRAIL 通路、线粒体代谢、ClpP 和 MGMT 以及潜在免疫作用在联合治疗疗效中的作用。此外，本研究的结果可能建立 ONC201 或 ONC206 联合 TMZ 和 RT 的 IRT 联合方案，用于有或无 H3K27M 突变和 MGMT 基因甲基化的肿瘤的靶向治疗。
局限性包括观察到的协同作用可能仅针对某些细胞系，这引发了对其在不同 GBM 肿瘤类型（包括具有和不具有 H3K27M 突变和 MGMT 基因甲基化的 GBM 肿瘤细胞、类器官和体内模型）中的普遍性的担忧。虽然机制方面的见解部分由 Western blot 分析提供，但需要进一步研究（例如转录组学或 RNA-Seq）以充分阐明分子通路并考虑潜在的脱靶效应。其他局限性包括缺乏使用同基因原位小鼠模型和患者来源的异种移植人源化免疫功能正常的原位 GBM 模型。缺乏免疫细胞亚群分析（例如 T 细胞和 NK 细胞群）和患者来源的模型，凸显了需要在更广泛的 GBM 亚型和免疫细胞亚型中进行验证。 TME 的复杂性，包括细胞外基质、基质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、细胞因子、肿瘤相关髓样细胞/巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、树突状细胞、GBM 细胞/胶质瘤干细胞等，可能显著影响治疗反应。
虽然前景光明，但仍需要进一步研究来证实这些发现并将其转化为临床实践。我们的数据表明 IRT 三联疗法（即 Imipridones ONC201 或 ONC206、替莫唑胺和放射疗法）之间存在协同作用，包括单一疗法或双重疗法中未见的生存曲线尾部。虽然我们观察到小鼠在采用无毒性的可实现给药方案时获得治疗益处，但这些发现支持进一步探索机制、PK、PD 生物标志物和体内活性。可在野生型 IDH1 GBM 和 H3K27M 突变的 DIPG 中使用 Imipridones 加 TMZ 药物组合以低于推荐的 2 期剂量并增加剂量同时进行 RT 来进行临床转化，因为三联疗法尚未在人体中进行过测试。
值得注意的是，我们观察到 ONC201 和 TMZ 在 H3K27M 突变的 SF8628 细胞中的协同作用，并且之前也报道过 TMZ 对高 MGMT 表达肿瘤细胞的 T 细胞免疫杀伤的影响，这一点具有临床意义。我们发现，在 SU-DIPG-36 细胞中，ONC201 抑制了单独使用 TMZ 时观察到的耗氧率，这可能是因为 ONC201 抑制了氧化磷酸化。我们还发现了 Imipridones 抑制 MGMT 表达的作用，从而可能使 MGMT 启动子未甲基化的肿瘤细胞对 TMZ 的抗肿瘤作用敏感。值得注意的是，在一线环境中使用 ONC201 治疗 H3K27M 突变的弥漫性神经胶质瘤的试验不包括 TMZ，而由于 MGMT 的未甲基化状态，TMZ 通常对这些肿瘤无效。然而，我们的结果表明，与 TMZ 联合使用时，咪唑吡啶可抑制 MGMT 表达，表明将 Imipridones 与 TMZ 联合用于中枢神经系统和其他类型的肿瘤具有潜在益处。因此，除了在 IRT 组合中使用外，还可以进一步利用 ONC201 或其他 Imipridones 与 TMZ 联合使用的协同作用和潜在有益的治疗效果。我们的结果支持进一步研究将 ONC201 或 ONC206 与 RT 和 TMZ (IRT) 联合用于野生型 IDH1 胶质母细胞瘤、H3K27M 突变的弥漫性胶质瘤或其他肿瘤。
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