2025年1月9日发表于

Journal of Orthopaedic Surgery and Research 

摘要

背景

评估间充质干细胞 (MSC) 衍生的外泌体疗法对牙周再生的治疗效果，并确定最近的临床前研究中与增强牙周再生相关的治疗因素。

方法

在 PubMed、Cochrane Library、EMBASE 和 Web of Science 数据库中进行了搜索，搜索时间截至 2024 年 10 月 10 日。使用 SYRCLE 工具进行偏倚风险 (ROB) 评估。成骨相关参数被用作主要结果测量指标。

结果

共计查明 1360 篇文章，其中 17 项临床前研究基于 MSC 衍生的外泌体疗法，与对照组相比，它们对 BV/TV（SMD=13.99；95% Cl=10.50, 17.48；p<0.00001）、CEJ-ABC（SMD=-0.22；95% Cl=-0.31, -0.13；p<0.00001）、BMD（SMD=0.29；95% Cl=0.14, 0.45；p=0.0002）和 Tp.Sp（SMD=-0.08；95% Cl=-0.15, -0.02；p=0.02）具有有益作用。然而， 外泌体治疗组和对照组之间的Tp.Th 无显著差异（SMD=0.03；95% CI=0.00, 0.07；p=0.09）。此外，亚组分析表明，预处理的外泌体（p=0.03）显著改善了 BV/TV。相反，在应用方法（p=0.29）、应用频率（p=0.10）、治疗持续时间（p=0.15）或 MSCs 来源（p=0.31）方面，BV/TV 的增强没有显著差异。

结论

MSC 衍生的外泌体在提高牙周再生质量方面表现出巨大潜力。然而，需要进行更标准化和更稳健的试验，以减少研究之间的异质性和偏差，并确认与 MSC 衍生的外泌体增强牙周再生相关的治疗参数。

介绍

牙周炎是一种慢性感染性疾病，是由外源性细菌侵入和内源性免疫失调引起的。其主要特征是牙周支持组织（包括牙周膜和牙槽骨）的炎症破坏，最终导致牙齿脱落。此外，牙周炎与 57 种全身性疾病有关，包括心血管疾病、糖尿病、慢性炎症性肠病和阿尔茨海默病。因此，牙周炎给医疗保健系统带来了沉重的负担。牙周炎的治疗方法侧重于防止病情进一步进展，减轻临床症状和患者报告的不适，促进潜在的组织再生，并支持健康牙周组织的长期保存。消除导致牙周疾病进展的牙菌斑滞留因素至关重要。例如，可以去除或重塑牙根解剖特征（如牙釉质珠和腭沟），以改善牙菌斑控制。此外，目前牙周治疗的临床方法主要包括龈下牙菌斑机械清创、局部和全身药物治疗以及各种牙周外科手术。然而，尽管做出了这些努力，实现完整和功能性的牙周组织再生仍然具有挑战性。

间充质干细胞 (MSC) 具有自我更新和分化为各种谱系的能力。由于其免疫调节和抗氧化特性，MSC 在组织再生治疗中已显示出一致且成功的结果。牙周膜干细胞 (PDLSC) 和牙髓干细胞 (DPSC) 等牙科干细胞以及骨髓间充质干细胞 (BMMSC) 等一系列非牙科干细胞已被证明在牙周再生中发挥重要作用。然而，基于干细胞治疗牙周再生的主要困难包括 MSCs 扩增过程中的去分化、再生潜力降低、移植后免疫细胞表型不稳定、自体干细胞稀缺、以及同种异体细胞移植相关的固有风险。

细胞外囊泡（EV）源自细胞膜并释放到细胞外空间，在细胞间通讯中发挥关键作用。根据分泌过程和特性，EV 可分为源自内体的外泌体（Exos）、源自质膜的微囊泡（MV）和凋亡小体（ApoEV）。外泌体是 EV 的重要组成部分，由双层脂质组成，可携带来自母细胞的氨基酸、蛋白质和核酸等多种分子。外泌体的直径从 30 到 150 纳米不等，具有促进细胞增殖、诱导干细胞迁移、减轻炎症和疼痛等治疗特性，使其成为组织再生的有前途的工具。临床试验为其安全性和有效性提供了更多证据。由于其低免疫原性、高安全性和多功能生物活性特性，越来越多的研究表明，来自 MSCs 的外泌体在免疫调节中起着关键作用，并且作为传统基于 MSC 的疗法的替代品具有巨大潜力。

尽管许多研究已经强调了 MSC 衍生的外泌体在牙周再生中的重要作用，但仍然缺乏定量、系统和全面的分析来研究 MSC 衍生的外泌体与牙周再生之间的关系。先前的荟萃分析评估了它们的功效，但尚未彻底评估各种因素对牙周组织再生的具体影响。在本研究中，我们进行了荟萃分析和系统评价，以全面评估牙周再生的动物模型，同时研究优化临床前试验设计的关键变量，以加速 MSC 衍生的外泌体疗法转化为临床实践。

材料和方法

本系统评价依据系统评价和荟萃分析的优选报告项目 (PRISMA) 指南和 PRISMA 2020 标准进行。该方案已在 PROSPERO 数据库中正式注册，该数据库是国际前瞻性系统评价注册库 (CRD42024546236) 的一部分。

搜索策略

我们使用医学主题词 (MeSH) 术语“外泌体”和“引导组织再生，牙周”对 PubMed、Web of Science 和 EMBASE 进行了全面搜索，以查找 2024 年 10 月 10 日之前发表的研究。

资格标准

纳入荟萃分析的研究符合以下标准：（1）提供了在动物中建立牙周炎或牙周缺损模型的详细程序；（2）全面描述了从 MSCs 中分离和表征外泌体的方法；（3）治疗组单独接受外泌体或在生物材料辅助下接受外泌体，而对照组则使用 PBS 或其他敷料；（4）报告了一个或多个可用的结果，例如骨体积/总体积 (BV/TV)、牙骨质-釉质连接和牙槽骨嵴 (CEJ-ABC)、骨矿物质密度 (BMD)、小梁厚度 (Tb.Th) 和小梁分离 (Tb.Sp)。

从荟萃分析中排除的研究符合以下标准：（1）未以英文发表的文章；（2）非随机对照试验，如评论、评论、社论、病例报告或会议摘要；（3）非源自 MSCs 的外泌体；（4）不可用或不可提取的数据。

研究选择

删除重复文献后，对剩余的参考文献进行详细筛选。通过查看标题和摘要进行初步筛选。随后，根据预先设定的资格标准，对符合初步标准的研究进行全面的全文审查。两名研究人员独立进行研究选择、质量评估和数据提取。如有分歧，则由第三名成员参与讨论以解决问题。

数据提取

数据是从符合条件的研究的全文、图表和补充材料中提取的，并由两项独立研究人员系统地列在我们预先设计的表格中。提取的数据包括研究特征（作者、出版年份）、动物模型特征（性别、年龄、体重、建模方法）、干预细节（外泌体的 MSCs 来源、修饰类型、浓度、频率和给药途径）、研究设计（载体、样本量、随访时长）和结果（BV/TV、CEJ-ABC、BMD、Tb.Th 和 Tb.Sp）。我们最初通过电子邮件联系作者，以便在必要时请求提供缺失数据（如样本量和原始数据）。当没有数值数据时，我们使用 WebPlotDigitizer 在线应用程序从图中提取数据。

质量评估和偏见风险

使用实验室动物实验系统评价中心 (SYRCLE) 工具评估偏倚风险，该工具专为动物研究而设计。该工具评估多个领域的偏倚：序列生成（选择偏倚）、基线特征（选择偏倚）、分配隐藏（选择偏倚）、随机饲养（绩效偏倚）、对人员实施盲法（绩效偏倚）、随机结果评估（检测偏倚）、对检测偏倚实施盲法（检测偏倚）、不完整结果数据（流失偏倚）、选择性结果报告（报告偏倚）和其他偏倚来源。

统计分析

将数据标准化为标准化平均差（SMD），并使用 Cochrane Review Manager 5.4 进行分析。由于所有结果都是连续的，因此效应估计值以 SMD 和 95% 置信区间（CI）表示。使用 I² 统计量评估符合条件的研究之间的异质性。P<0.05 被认为具有统计学意义。进行了亚组分析和异质性探索，以探索潜在的变异来源。在荟萃分析中采用了随机效应模型，该模型解释了由于临床和方法学差异导致的显著异质性。亚组分析包括外泌体修饰、生物材料辅助递送、外泌体来源、治疗频率和治疗时机等因素。

结果

搜索结果

图1展示了一个流程图，详细说明了符合条件的研究的综合选择过程。最初从 PubMed、EMBASE 和 Web of Science 数据库中确定了总共 1360 篇文章。删除重复项后，803 项研究被纳入分析。最终，符合纳入标准并报告了 MSC 衍生外泌体在牙周再生动物模型中的功效的 17 项临床前研究被纳入荟萃分析。

图1. 研究选择程序的流程图

研究特征

所审查的文章发表于 2019 年至 2024 年之间，表明人们对 MSC 衍生的外泌体用于牙周再生的兴趣日益浓厚。每项选定研究中外泌体的特征和应用方案分别详见表1和表2。采用了各种动物模型，最常用的是 Sprague Dawley (SD) 大鼠 (n=11)，其次是 C57BL/6 小鼠 (n=4)、Wistar 大鼠 (n=1) 和比格犬 (n=1)。在疾病模型方面，九项研究侧重于牙周缺损，六项研究侧重于牙周炎，两项研究同时侧重于两者。外泌体来源于不同的 MSCs，其中 11 项研究来源于牙髓干细胞外泌体，6 项研究来源于非牙髓干细胞外泌体。牙髓干细胞外泌体包括 PDLSC (n=6)、DFSC (n=2)、人脱落乳牙 (SHED) (n=2) 和根尖乳头干细胞 (SCAP) (n=1)。对于非牙髓干细胞外泌体，BMMSC 是最常见的 (n=5)，其中一项研究使用脐带间充质干细胞 (UCMSC) (n=1)。所有 17 项研究均通过局部注射或与生物材料结合使用局部外泌体来促进牙周再生。外泌体治疗的频率各不相同，包括单次给药、每三天给药和每周给药。各试验的样本收集时间从 10 天到 8 周不等。

表1. 纳入文献的主要特征

表2. 全部纳入文章的外泌体应用方案总结

偏见风险

总体而言，大多数符合条件的研究的偏倚风险尚不明确。几篇文章提到动物组是随机分配的；但是，没有提供随机化程序和分配隐藏方法的详细描述。所有文章都表明，实验开始时，干预组和对照组的基线特征是可比的。只有一项试验报告了人员盲法。所有研究均未发现选择性报告或其他偏倚来源。

荟萃分析

这项荟萃分析纳入了 17 项研究，重点关注五个主要结果：来自 14 项研究的 BV/TV、来自 5 项研究的 CEJ-ABC、来自 3 项研究的 BMD、来自 3 项研究的 Tb.Th 和来自 3 项研究的 Tb.Sp。

BV/TV

在我们的荟萃分析中，14 项符合条件的研究报告了 BV/TV 作为结果测量。总体而言，与对照组相比，使用 EV 的 BV/TV 显著增加（SMD=13.99；95% Cl=10.50, 17.48；p<0.00001）（图2），尽管异质性相对较高 。在这些研究中，有 11 项研究表明外泌体组与对照组相比有益，而有 3 项研究没有显著差异。漏斗图的对称性表明纳入的研究的出版偏倚风险较低。我们进一步进行了亚组分析，以检查各种因素的影响，包括预处理、应用方法、注射频率、治疗持续时间和间充质细胞类型（表3）。值得注意的是，利用预处理作为 EV 修饰手段的研究（SMD=21.84; 95% Cl=13.18, 30.50; p<0.00001）显示 与未进行预处理的研究相比，BV/TV 有显著改善（p<0.00001）（SMD=11.15; 95% CI=6.80, 15.50; p<0.00001）。在六项研究预处理的 MSC 衍生外泌体的研究中，探索了各种方法，包括基因转染、3D 培养、细胞因子刺激和物理刺激。尽管使用和不使用生物活性材料都有助于改善 BV/TV（p=0.29），但在统计学上没有显著差异。亚组分析表明，在应用频率（p=0.10）、治疗持续时间（p=0.15）或 MSC 类型（p=0.31）方面，BV/TV没有显著差异。

图2. 森林图分析评估 MSC 衍生的外泌体治疗对 BV/TV 的影响与对照组相比

表3. BV/TV 亚组分析

CEJ-ABC

五篇文章报道了 CEJ-ABC 的均值和 SD。CEJ-ABC 是牙槽骨吸收的重要指标，其测量距离直接反映了吸收的程度。MSC 衍生的外泌体的应用有效降低了 CEJ-ABC 之间的距离，如 SMD 及其 95% CI 所示（SMD=-0.22；95% Cl=-0.31,-0.13；p<0.00001）。但异质性检验显示 I 2=98%，表明异质性程度较高（图3）。

图3. 森林图分析评估 MSC 衍生的外泌体治疗对 CEJ-ABC 的影响与对照组相比

骨密度

纳入了三项符合要求的研究来评估 BMD。所有这些因素都对 BMD 产生了统计学上显著的影响。总体分析显示 MSC 衍生的外泌体增强了 BMD（SMD=0.29；95% Cl=0.14, 0.45；p=0.0002）（图4）。

图4. 森林图分析评估 MSC 衍生的外泌体治疗对 BMD 的影响与对照组相比

Tp.Th

3项研究表明外泌体对Tp.Th有影响，外泌体治疗组与对照组的Tp.Th无显著差异（SMD=0.03；95% CI=0.00, 0.07；p=0.09），可能受参考文献局限性的影响（图5）。

图5. 森林图分析评估 MSC 衍生的外泌体治疗对 Tp.Th 的影响与对照组相比

磷酸二酯酶

另有三项研究（包括五项试验）报告了Tb.Sp。汇总结果显示，外泌体组的Tp.Sp明显低于对照组（SMD=-0.08；95% Cl=-0.15，-0.02；p=0.02），表明MSC衍生的外泌体缩短了骨小梁之间的平均距离。较低的Tp.Sp值表示骨小梁更致密、更紧密，从而增强了骨微结构（图6）。

图6. 森林图分析评估 MSC 衍生的外泌体治疗对 Tp.Sp 的影响与对照组相比

讨论

这项荟萃分析旨在根据成骨指标 BV/TV、CEJ-ABC、BMD、Tb. Th 和 Tb.Sp，检查 MSC 衍生的外泌体在牙周炎或牙周缺损临床前模型中的治疗潜力。根据 17 项符合条件的研究的结果，MSC 衍生的外泌体被证明可以显著促进牙周骨再生。然而，我们的结论受到研究间巨大异质性的限制。虽然我们无法通过亚组分析确定这种异质性的具体来源，但我们观察到修饰方法、生物支架、应用频率、治疗持续时间和 MSC 来源的差异可能会影响牙周组织再生。因此，我们的研究表明基于 MSC 衍生的外泌体的治疗可能对牙周再生有希望，并为优化临床前研究设计提供了有价值的见解。

BV/TV是新骨形成的关键指标，在大多数纳入的研究中均显示出显著的增加。CEJ-ABC能直接反映牙槽骨吸收的程度，在牙周病的诊断和治疗中具有重要的临床价值。外泌体的使用显著缩短了CEJ-ABC距离，从而促进了牙周组织再生。BMD是评估骨组织矿物质含量、反映骨强度和质量的指标，在本研究中表现出进步。此外，Tb.Sp的降低表明松质骨中的小梁结构增强。虽然在亚组分析中只有BV/TV预处理的效果显示出显著差异，但我们仍然认为外泌体治疗的治疗效果可能受特定因素的影响，导致不同生物活性化合物及其相关信号通路的变化。总的来说，这些变化表明骨骼健康的改善，为评估MSC衍生的外泌体治疗在牙周骨组织再生中的疗效提供了重要证据。然而，只有有限数量的研究报道了其他牙周组织，例如定向牙周膜纤维和新形成的牙骨质的重新形成，这些对于实现完全牙周再生具有挑战性但至关重要。

虽然BV/TV的亚组分析未揭示牙齿和非牙齿干细胞之间的显著差异，但来自不同细胞类型的外泌体可以在不同的生理和病理条件下以及亲本细胞所在的不同微环境中发挥不同的作用。在我们的研究中，牙齿干细胞是牙周再生最常用的外泌体来源，可能是因为它们具有胚胎样特性和与口腔组织的同源性。在11项关于牙齿干细胞外泌体的研究中，有6项集中于PDLSC，PDLSC被认为是牙槽骨再生最有效和最有据可查的干细胞疗法。此外，位于牙囊中的DFSC在发育和功能上都与PDLSC密切相关，这使其成为研究人员的热门选择。非牙科来源的BMMSC 也广泛用于牙周再生，因为它们具有自我更新能力和分化为成骨谱系的能力。尽管之前的系统评价已经证明 MSC 可以促进骨再生，但来自 MSC 的外泌体在质量和数量上都提供了更大的再生潜力，这可能是因为它们能够携带更多样化的生物分子，如蛋白质、RNA 和脂质，从而有助于改善愈合效果。因此，确定最适合牙周再生的来自不同干细胞的外泌体来源仍然是一个挑战，因为目前关于这个主题的研究有限。

鉴于外泌体研究的进步和成功，修饰的外泌体比天然外泌体吸引了更多的关注，这主要是因为它们具有增强的治疗效果，这可以归因于更高的产量、靶向递送能力和特殊的成分。我们的荟萃分析一致表明，与使用未修饰的 MSC-sEV 的研究相比，涉及修饰的 MSC 衍生的小细胞外囊泡 (MSC-sEV) 的研究在 BV/TV 方面获得了更优的结果。修饰 MSC 衍生外泌体的主要策略之一是对亲本细胞进行预处理，包括 3D 或缺氧培养、外泌体工程、炎症预处理和机械刺激等技术（图7）。这种预处理会改变外泌体的货物，包括蛋白质和核苷酸，从而增强 MSC 衍生的外泌体对细胞迁移、增殖、抗炎反应、血管生成和成骨的生物活性作用，这些对于牙周再生至关重要。例如，增强的血管生成可能归因于 MSCs 的 3D 培养激活了 HMGB1/AKT 信号传导和缺氧诱导因子 (HIF-1α)。最近的一项研究构建了一种工程化的 CXCR4 过表达外泌体，该外泌体负载了 miR-126，可有效地将其货物运送至巨噬细胞，缓解牙周炎并减轻牙槽骨质流失。细胞因子预处理，如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β) 和转化生长因子-β1 (TGF-β1)，已被证明可以丰富外泌体中的 miRNA，包括 miRNA-299-3p、miR-146a、miRNA-147b 和 miRNA-135b，有助于减少炎症和增强骨再生。LPS 预处理的 DFSC-sEVs 中高表达的蛋白质主要参与抗氧化和酶调节活性。此外，低强度脉冲超声 (LIPUS) 可通过增加外泌体内 miR-328-5p、miR-487b-3p 和 miR-935 的水平，为减轻牙周组织炎症和防止骨吸收提供了一种可行且有效的方法。因此，选择适当的修饰技术或多种装载方法的组合已被证明可有效提高外泌体的装载潜力。然而，旨在优化治疗效果的外泌体修饰的具体机制仍不清楚，需要进一步研究。

图7. MSC-sEV 的各种预处理方法和给药途径

虽然所有纳入的研究都利用了外泌体在动物模型上的局部应用来促进牙周组织再生，但将外泌体直接注射到牙周缺损中会因暴露于唾液流和牙周袋而导致快速释放，从而妨碍持续治疗效果。因此，实现外泌体的高装载效率和可控的保留稳定性对于加速临床转化应用至关重要。同样，我们的荟萃分析证实，与直接注射外泌体的研究相比，MSC衍生的外泌体与生物材料辅助支架的组合提高了骨愈合效果。生物活性陶瓷、水凝胶和合成聚合物被广泛用作外泌体递送系统中的支架材料。生物活性陶瓷，如羟基磷灰石（HA）和β-磷酸三钙（β-TCP），具有与天然骨相似的矿物结构，表现出优异的骨传导性和骨诱导性。当与 MSC 衍生的外泌体结合时，它们在牙周炎大鼠模型中表现出比其他支架更优异的牙槽骨形成效果。透明质酸(HA)、壳聚糖 (CS)、丝素蛋白 (SF)、海藻酸钠 (ALG) 和聚乙二醇 (PEG) 等水凝胶是由天然或合成聚合物形成的亲水性三维网络。这些水凝胶具有先进的生物降解性和生物相容性，有望成为外泌体载体的支架。然而，体内快速降解和较差的机械强度限制了它们在组织再生中的应用。为了解决这一问题，已经开发出环境响应性水凝胶和复合支架。例如，温度响应型 PF127 水凝胶和 3D 打印的 SF/COL-I/nHA 支架已显示出促进牙周炎牙槽骨再生的巨大潜力。外泌体递送方法正朝着更智能、多功能和可持续的方向发展，推动再生医学的进一步发展。

这项荟萃分析有几个局限性。首先，根据 SYRCLE 偏倚风险工具的评估，纳入的大部分研究质量相对较低，许多研究被评为“不清楚”。其次，尽管根据 MSCs 的来源、生理状态和 MSCs 的培养条件进行了亚组分析，但支架的使用、治疗频率和愈合时间并没有降低异质性。因此，外泌体对牙周组织再生的积极作用的可信度有限。第三，牙周缺损或牙周炎的动物模型可能无法完全复制人类牙周炎中观察到的病理生理变化。有必要改进临床前模型的构建，以增强其临床相关性。此外，结果测量有限，主要关注牙周骨的质量和数量，而很少有研究涉及其他牙周结构的再生，例如牙骨质和牙周韧带。

结论

通过系统回顾和荟萃分析，我们初步得出结论，MSC 衍生的外泌体在促进牙周再生方面具有显著功效。然而，为了明确外泌体的最佳来源、合适的浓度和理想的支架选择以及给药频率和持续时间，未来的研究应侧重于开展大规模、高质量的随机对照试验和长期随访。此外，将工程化外泌体与组织工程策略相结合，旨在提高其在体内的循环时间、靶向能力和药物递送效率，将进一步扩大外泌体在牙周组织再生中的潜在应用，从而加速其临床转化。