2025年2月4日发表于

Annals of Oncology

亮点：

•对 143 名接受 KRAS G12C i治疗的患者的进展后无细胞 DNA 测序数据进行了评估

•获得性 RAS/MAPK 变异是 KRAS G12C i 耐药性的关键驱动因素，在 CRC 中比在 NSCLC 中更常见

•很大一部分 CRC 患者同时出现多种耐药性改变，影响不同的改变类型

•第一代 KRAS G12C i 表现出相似的耐药性，但 KRAS switch-II 突变除外

•新型 (K)RAS 抑制剂可能克服不同类型的 RAS/MAPK 抗性改变

摘要

背景

KRAS G12C突变选择性抑制剂(KRAS G12C i) 已证明对 KRAS G12C癌症有效。然而，耐药性不可避免地会产生，导致反应时间短暂。我们旨在确定获得性 KRAS G12C i 耐药性的基因组概况，并阐明新型 KRAS 抑制剂是否可以克服这些耐药机制。

方法

为了评估获得性耐药性改变的临床频率，我们评估了美国两家癌症中心接受 KRAS G12C i治疗的患者的进展后无细胞 DNA 样本的基因组测序数据，以及六项先前发表的研究数据。使用工程细胞模型进行细胞活力测定，以功能验证候选耐药驱动因素并评估新型 KRAS 抑制剂。

结果

共分析了 143 名患者。大多数患者患有非小细胞肺癌 (NSCLC，n=68) 或结直肠癌 (CRC，n=58)，并接受单药 KRAS G12C i (n=109) 或与抗 EGFR 抗体 (n=30) 联合治疗。46% 的患者 (n=66) 出现 RAS/MAPK 变异，其中 39% 的患者出现 ≥1 个新的 KRAS 变异 (n=56)，23% (n=33) 出现多个并发变异。获得性变异的基因组图谱包括 KRAS 激活突变（25% 的患者）、KRAS 扩增（22%）、RAF/MAPK 突变/融合（21%）、KRAS switch-II 口袋突变（14%）和 NRAS/HRAS 突变（8%）。值得注意的是，CRC 中 ≥1 种获得性 RAS/MAPK 变异的患者比例明显高于 NSCLC（69% vs. 26%，p<0.001）。功能研究证实大多数变异是耐药驱动因素。Sotorasib、adagrasib 和 divarasib 对 KRAS switch-II 口袋突变表现出不同的活性，但均对 RAS(ON) G12C 选择性三复合物抑制剂 RM-018 有反应。KRAS 选择性抑制剂 Pan-KRAS-In-1 可有效靶向 KRAS 激活突变，而 RAS(ON) 多选择性三复合物抑制剂 RMC-7797 对所有 RAS 变异均表现出高效力。

结论

获得性 RAS/MAPK 变异是导致 CRC 和 NSCLC 中检测到的 KRAS G12C i耐药性的反复驱动因素，但这种情况较少见。临床前数据表明，新型 (K)RAS 抑制剂可以克服许多此类耐药变异。

介绍

KRAS 在实体和血液系统恶性肿瘤中的总体患病率约为 20%，是人类癌症中突变最频繁的致癌基因。胰腺癌 (PC)、结直肠癌 (CRC) 和非小细胞肺癌 (NSCLC) 中观察到 KRAS 突变率最高，这些癌症合计占西方世界癌症相关死亡人数的三分之一以上。RAS 家族（KRAS、NRAS 和 HRAS）是膜结合 GTPase 蛋白，可在无活性 GDP 结合的关闭状态和活性 GTP 结合的开启状态之间切换。RAS 突变通过损害 GTP 水解来破坏这一严格调控的循环，使平衡转向 GTP 结合的开启状态。这导致下游致癌信号的组成性激活，特别是通过 RAS/MAPK/ERK 和 PI3K/AKT/mTOR 通路。

突变选择性 KRAS G12C i 的突破性临床开发为直接靶向 KRAS 提供了前所未有的机会，而此前人们认为 KRAS 是无法用药的。通过利用 KRAS G12C蛋白开关 II 区下方的小分子药物结合口袋，这些药物与突变半胱氨酸残基形成共价键，从而将突变蛋白困在其无活性的 GDP 结合状态。Sotorasib和adagrasib是第一种在 KRAS G12C预处理的非小细胞肺癌中表现出疗效的突变选择性共价 KRAS G12C i，其缓解率达到30%-40%，这导致 EMA 和 FDA 批准这两种药物用于这种治疗。相比之下，在 KRAS G12C结直肠癌中，sotorasib 和 adagrasib 仅表现出中等单药活性，缓解率约为 10%-20%，这是由于通过 RTK 介导的 RAS/MAPK 信号通路的重新激活，迅速出现了适应性耐药性。这些发现促使人们在 CRC 中进行 KRAS G12C i 与抗表皮生长因子受体 (EGFR) 抗体联合治疗的临床试验，结果显著提高了疗效。在 KRYSTAL-1 试验中，缓解率从单药 adagrasib 的 19% 增加到与抗EGFR抗体西妥昔单抗联合使用的 34%，因此 FDA 批准这种组合用于治疗既往接受过治疗的 KRAS G12C结直肠癌。Sotorasib 和 adagrasib 还已在其他 KRAS G12C胃肠道恶性肿瘤（包括胰腺癌）中表现出临床活性，表明具有肿瘤类型不可知性作用。其他几种突变选择性共价 KRAS G12C i，包括 divarasib、olomorasib、garsorasib 和 glecirasib，正在接受临床研究，并已显示出令人鼓舞的早期疗效信号。

尽管取得了这些有希望的进展，但 KRAS G12C i ± 抗 EGFR 抗体的缓解持续时间仍然有限，KRAS G12C NSCLC 的中位无进展生存期为 6-13 个月，KRAS G12C CRC 和其他胃肠道恶性肿瘤的中位无进展生存期为 4-8.1 个月。限制 KRAS G12C i临床益处的获得性耐药的一个关键驱动因素被认为是由新获得的基因组改变的出现导致 RAS/MAPK 信号通路重新激活所介导的。然而，先前报告不同 KRAS G12C i 中获得性 RAS/MAPK 改变率不同的研究要么仅限于小规模病例系列，要么没有对 KRAS G12C i 类中获得性改变的基因组状况进行深入表征。此外，关于新出现的变异对不同 KRAS G12C i的影响的功能数据仍然很少。此外，最近出现了新型 (K)RAS 抑制剂，例如 RAS(ON) 突变型和多选择性三复合物抑制剂和 KRAS 异构体选择性抑制剂，目前正在进行早期临床试验评估，这为针对 KRAS G12C i获得性耐药机制提供了前所未有的机会。

在本研究中，我们整合了 143 名患者的个体患者数据的汇总分析，这些患者接受了 KRAS G12C i 进展后游离 DNA (cfDNA) 基因组测序以及临床前研究，以全面定义获得性 RAS/MAPK 通路对 KRAS G12C i的耐药性的基因组概况，并阐明针对和克服耐药性的潜在治疗策略。

方法

研究设计和患者人群

对于临床获得性耐药性改变的个体患者数据的汇总分析，我们考虑了患有 KRAS G12C实体恶性肿瘤的患者，他们 (i) 曾接受过 KRAS G12C i 治疗，(ii) 在临床耐药时接受了配对进展后无细胞 DNA (cfDNA) 基因组测序以及治疗前组织或 cfDNA 基因组测序，并且 (iii) 病情稳定至少 12 周或对 KRAS G12C i 治疗表现出初步部分或完全反应。选择这些标准是为了专门评估获得性耐药机制。在截至 2024 年 10 月 1 日使用 MEDLINE、Embase 和 Cochrane Library 进行全面的文献研究后，我们使用搜索词“KRAS G12C 抑制剂”、“基因组分析”和“获得性耐药”，确定了六项研究，这些研究提供了临床获得性 KRAS G12C i耐药时详细的患者级基因组测序数据。。将这些患者与麻省总医院和 MD 安德森癌症中心接受 KRAS G12C i 治疗的 23 名患者相结合，总共有 143 名患者符合我们的纳入标准并被纳入分析。我们机构入组的所有患者均提供了书面知情同意书，研究按照《赫尔辛基宣言》进行。

基因组测序

使用市售的下一代测序检测 GuardantOMNI、Guardant360 CDx(Guardant Health)和 FoundationOneLiquid CDx(Foundation Medicine)对麻省总医院和 MD 安德森癌症中心接受治疗的 23 名患者进行了 cfDNA 测序。

工程细胞系的产生

含有目标变异的 pDONR 质粒可直接从 Addgene 获取，也可使用 Agilent Technologies QuikChange II 定点诱变试剂盒在设计和订购特定引物后生成。随后使用 Invitrogen Gateway LR Clonase II 酶混合物将突变载体转入 pLENTI-puro 载体，并通过全质粒纳米孔测序进行验证。通过将 pLENTI 载体连同包装质粒转染到 HEK293T 细胞中，生成针对每个目标变异的慢病毒。最后通过慢病毒转导和嘌呤霉素选择将突变基因引入 MIA PaCa-2（KRAS G12C胰腺导管腺癌）细胞系。

细胞培养

所有细胞系均在青霉素-链霉素存在下于 37°C 和 5% CO2 下培养，并定期检测支原体感染情况。MIA PaCa-2 细胞系在补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM/F12 中培养。HEK293T 细胞在补充有 10% FBS 的 DMEM 中生长。

细胞活力

对于剂量反应增殖试验，将细胞以每孔 1000 个细胞的密度接种在 96 孔板中，重复三次，孵育 24 小时，然后暴露于剂量范围为九种不同浓度的所示药物中 72 小时。使用 CellTiter-Glo 测定法 (Promega) 评估细胞活力。使用非线性拟合剂量反应模型，通过 Prism (GraphPad) 确定每种药物生长抑制的半最大抑制浓度 (IC50)。从至少三个独立实验计算 IC50 的倍数变化，并以平均值和标准误差显示。RM-018 和 RMC-7977 由 Revolution Medicines 提供。其他化合物从 MedChemExpress 购买。

无细胞 DNA 提取和 ddPCR

将全血收集在 Streck 管中，并通过两个离心步骤分离血浆。使用 QIAamp 循环核酸试剂盒进行 DNA 提取。对于 ddPCR 实验，将 DNA 模板（最多 10 μL，每个样本总共 20 ng）添加到 10 μL ddPCR Supermix for Probes（Bio-Rad）和 2 μL 自定义引物/探针混合物中。将此反应混合物与 60 μL 液滴生成油 for Probes（Bio-Rad）一起添加到 DG8 墨盒中，用于液滴生成和热循环。使用 QX200 液滴读取器（Bio-Rad）分析液滴，以对 FAM 和 HEX 探针进行荧光测量。根据阳性和阴性对照建立门控阈值，以识别突变种群。使用 QuantaSoft 分析软件 (Bio-Rad) 分析 ddPCR 数据，以获得野生型/正常背景下突变 DNA 等位基因的分数丰度。等位基因分数计算如下：AF%=[Nmut/(Nmut + Nwt) × 100]，其中 Nmut 是突变等位基因的数量，Nwt 是每个反应的野生型等位基因的数量。始终包括正常对照血浆 DNA 和无 DNA 模板对照的 ddPCR 分析。

统计分析

计数变量以绝对频率和相对频率报告。使用卡方检验比较了各组（例如 CRC 与 NSCLC）中具有获得性变异的患者比例。实施单变量和多变量逻辑回归模型来分析基线变量（肿瘤类型、KRAS G12Ci 药物、治疗方式）与获得性耐药变异发展之间的关联。所有统计分析均使用 Stata 16.0（Stata Corp.）和 Prism（GraphPad）进行。

结果

获得性 RAS/MAPK 通路改变的基因组图谱

为了表征导致对不同 KRAS G12 i产生耐药性的获得性 RAS/MAPK 变异谱，我们评估了 143 名 KRAS G12C癌症患者（涉及 8 种不同的肿瘤类型）的 cfDNA 进展后新一代测序数据。大多数患者患有 NSCLC（n=68）或 CRC（n=58），并接受 adagrasib（n=62）、sotorasib（n=30）或 divarasib（n=42）治疗，作为单一疗法（n=109）或与抗 EGFR 抗体联合使用（n=30）。（表1）

表1. 研究队列的临床特征。所有患者均在临床耐药时接受配对进展后无细胞 DNA (cfDNA) 基因组测序，以及治疗前组织或 cfDNA 基因组测序。

在我们有进展后 KRAS G12C状态数据的患者中，86% 的患者在临床耐药时检测到了原始 KRAS G12C突变。总体而言，66 例患者 (46%) 在接受 KRAS G12 i 治疗后临床进展时出现至少一种获得性 RAS/MAPK 改变，33 例患者 (23%) 表现出影响该通路的多种同时发生的改变（图1和2a）。值得注意的是，1 例接受阿达格拉西和抗 EGFR 抗体西妥昔单抗联合治疗的 CRC 患者出现了 13 处新出现的 RAS/MAPK 改变。总共检测到 55 种不同的改变，包括单核苷酸变异、基因扩增和基因融合。56 例患者 (39%) 出现二次 KRAS 改变，而 34 例患者 (24%) 出现非 KRAS 改变。为了更详细地描述基因组图谱，我们将观察到的改变分为五类。在 31 名患者 (22%) 中检测到 KRAS 的扩增或拷贝数增加。36 名患者 (25%) 发生获得性激活 KRAS 突变，其中最常见的是密码子 12 和 13 突变。20 名患者 (14%) 出现 KRAS 开关 II 口袋突变，影响第一代 KRAS G12C i 的药物结合位点，其中最常见的是 KRAS Y96D。在 12 名患者 (8%) 中发现了其他 RAS 亚型 NRAS 和 HRAS 的改变，主要是 NRAS 密码子 61 中的单核苷酸变体。30 名患者 (21%) 发生了 RAF 和 MAP2K 基因变异，这两个基因编码了通路中 RAS 下游的蛋白质，其中 MAP2K1 K57和 BRAF V600E突变最为普遍。图2a说明了整个队列中每种变异类别的分布情况。一半发生获得性 RAS/MAPK 变异的患者表现出涉及不同变异类别的共存耐药机制。仅有 KRAS 和仅有 RAS 变异的患者的频率分别为 23% 和 27%。总体而言，25 名患者 (18%) 在对 KRAS G12Ci 产生临床耐药时出现新出现的 RTK 扩增/融合，其中 MET 扩增最为常见 (n=12；8%)。

图1. 143 名患者中KRAS G12C i临床进展时新获得的 RAS/MAPK 通路改变的基因组图谱。每列代表一名患者。

图2. KRAS G12C i上新近获得性 RAS/MAPK 通路改变的频率和分布。（A）总体队列、（B）CRC 亚组和（C）NSCLC 亚组中。

不同肿瘤类型和 KRAS G12C抑制剂中 RAS/MAPK 获得性变异的发生频率

接下来，我们试图确定与发生 RAS/MAPK 抗性变异倾向相关的因素。我们观察到，与 NSCLC 患者相比，CRC 患者中发生新获得性变异的比例明显更高。具体来说，69% 的 CRC 患者至少有一种获得性变异，50% 的患者有两种或两种以上获得性变异，而 NSCLC 患者分别为 26% 和 4% (p<0.001)（图2b/2c）。此外，CRC 的基因组图谱显示出更大的多样性，并且每种变异类别的频率更高（图3）。CRC 中“二次打击”KRAS 变异的频率为 62%，NSCLC 中为 12%。值得注意的是，在不同肿瘤类型中观察到相关的治疗相关差异，例如 KRAS G12C i类型分布不均。为了解释潜在的混杂因素，我们进行了多变量逻辑回归分析，其中包括肿瘤类型、KRAS G12C i 药物和治疗方式（单一药物 vs. 联合抗 EGFR 抗体）。重要的是，与 NSCLC 相比，CRC 发生任何 RAS/MAPK 变异的倾向仍然高出 3 倍（调整后的优势比：3.02，95%CI：1.04-8.71，p=0.041）。

图3. CRC和 NSCLC 中按肿瘤类型分层的KRAS G12C i 新获得性 RAS/MAPK 通路改变的基因组图谱。

尽管使用 adagrasib (48%) 和 divarasib (60%) 的患者发生获得性 RAS/MAPK 变异的比例高于使用 sotorasib (22%) 的患者比例，但这种关联在多变量调整后减弱，未达到统计学意义。关于治疗方式，与单药 KRAS G12C i 相比，联合 KRAS G12C i + 抗 EGFR 抗体治疗与发生 RAS/MAPK 变异的概率显著增加相关(调整后的优势比：6.39，95%CI：1.77-23.1，p=0.005)。在 CRC 患者中，联合治疗中至少有一种获得性 RAS/MAPK 变异的患者比例为 90%，单药治疗中为 46%。在根据实体肿瘤疗效评价标准 (RECIST) 提供治疗反应数据的患者中，基于放射学反应的获得性改变的频率或格局没有显著差异。具体而言，新出现的 RAS/MAPK 改变的患者比例在病情稳定的患者中为 52%，在部分缓解的患者中为 51%（p=0.885）。未观察到完全缓解。

KRAS G12C抑制剂获得性耐药的克隆动态

有趣的是，虽然在大多数出现获得性 RAS/MAPK 耐药变异的患者 (90%) 中检测到了原始 KRAS G12C突变，但 4 名新出现变异的患者并未显示原始 KRAS G12C变异，这表明获得性耐药模式不同。为了更好地了解 KRAS G12C i 获得性耐药的克隆动态，我们评估了麻省总医院 16 名接受 KRAS G12C i治疗的患者的 ctDNA 系列血浆样本中突变等位基因频率 (MAF) 的纵向轨迹。图4中显示的两例患者病例说明了 KRAS G12C i 获得性耐药模式的不同。在病例 1（图4a）中，对阿达格拉西布 + 西妥昔单抗的临床耐药是由于同时出现的多个亚克隆 KRAS 变异伴随着原始 G12C 突变的再次出现。相比之下，在案例 2（图4b）中，该案例代表了临床耐药时未显示原始 G12C 的患者之一（ID：104），在阿达格拉西布 + TNO155 的选择性治疗压力下，观察到 G12V 和 G12C 克隆分别独立富集和抑制，在后续治疗中停用 KRAS G12C i 后，这些轨迹发生逆转。在这两种情况下，cfDNA 中耐药克隆的出现都比放射学进展早约 100 天，这表明这是耐药性的早期指标。

图4. KRAS G12C i获得性耐药的动力学。通过定制的突变特异性液滴数字 PCR 在治疗前和治疗期间收集的连续 cfDNA 样本中评估耐药性改变的突变等位基因频率 (MAF)。患者 99 ( A ) 是一名 66 岁的女性，患有 KRAS G12C转移性直肠腺癌，在接受 FOLFOXIRI+贝伐单抗和曲氟尿苷/替吡嘧啶+贝伐单抗治疗后病情出现进展，开始接受阿达格拉西布 + 西妥昔单抗作为姑息性第三线治疗。经过一轮阿达格拉西布 + 西妥昔单抗治疗后，观察到克隆性 KRAS G12C和 APC R1114∗突变几乎完全清除，MAF 低于 0.05%。两轮治疗后进行的第一次分期一致显示多个转移部位的大小减小（根据 RECIST 病情稳定）。治疗 100 天后，连续 cfDNA 分析显示 KRAS G12C突变反弹增加，同时出现四个新获得的 KRAS 耐药性变异，两个激活位点突变（G12D、G12L）和两个 switch-II 口袋药物结合位点（Y96D、Y96N），这些变异在放射学疾病进展前约五个月出现。除了 KRAS G12C，这些变异还显示，在随后的 adagrasib 与 SHP-2 抑制剂 TNO155 联合治疗中，MAF 水平进一步升高，由于疾病进展，该治疗在第一次分期后停止。(B)显示了一名 74 岁女性 KRAS G12C转移性肺腺癌患者的克隆耐药动态的独特模式。在开始使用二线阿达格拉西布联合 TNO155 (NCT04330664) 治疗后，G12C 突变体迅速且持续清除，治疗后约 120 天出现单一 KRAS G12V耐药性改变，比疾病进展早约 3 个月。值得注意的是，虽然 G12C 水平正在上升，但 G12V 耐药性改变在随后使用 ERK 抑制剂 ASTX029 (NCT03520075) 治疗时消失，但在再次使用另一种 KRAS G12C i sotorasib时出现明显反弹，随后疾病迅速进展。

图5. 三种 KRAS G12C i。(A) Sotorasib、(B) Adagrasib 和 (C) Divarasib、RAS(ON) G12C 选择性三复合物抑制剂 RM-018 (D)、异构体选择性 KRAS 抑制剂 Pan KRAS In 1 (E) 和 RAS(ON) 多选择性三复合物抑制剂 RMC-7977 (F) 的体外效力针对表达所示 RAS/MAPK 改变的 KRAS G12C MIA PaCa-2 细胞，包括以反式表达的五种活化 KRAS 突变 (G12A、G12D、G12V、G13D、Q61H)、以顺式表达的四种 KRAS 开关 II 口袋突变 (R68S、H95N、Y96D 和 Q99L)、两种 NRAS 突变 (Q61K 和 Q61R) 和一种下游 RAF/MAPK 改变(MAP2K1 K57N )。倍数变化 IC50 表示相对于 KRAS G12C单突变 MIA PaCa-2 对照细胞系，感染所示载体的 MIA PaCa-2 细胞的 50% 生长抑制效果 (IC50) 的倍数变化。数据来自用所示药物治疗 72 小时后进行的三次独立细胞活力测定实验。* IC50 的倍数变化超过 100。

对不同 KRAS G12C 抑制剂耐药性的候选药物的临床前验证

接下来，我们旨在解释三种 KRAS G12C（即 sotorasib、adagrasib 和 divarasib）对各种临床观察到的 RAS/MAPK 变异的活性特征的潜在差异。为此，我们通过改造 KRAS G12C MIA PaCa-2 细胞系，使其除了内源性 KRAS G12C突变外，还表达一系列常见 RAS/MAPK 抗性突变，从而生成了一个双突变细胞系库。使用细胞活力测定，我们首先评估了每种目标药物在单突变 KRAS G12C表达 MIA PaCA-2 对照细胞系中的半最大抑制效果 (IC50)。虽然 sotorasib (IC50：12.75nmol/l) 和 adagrasib (IC50：17.88nmol/l) 的平均 IC50 相当，但 divarasib 的效力高出 50 多倍 (I50：0.19nmol/l)。接下来，我们评估了表达各种假定抗性改变的双突变细胞系中每种药物的 IC50 倍数变化，相对于单突变对照细胞系中的 IC50。所有 KRAS 激活突变以及 NRAS 和 MAP2K1 突变都对 sotorasib、adagrasib 和 divarasib 产生了明显的抗性，IC50 增加了 10 多倍。为了评估激活 KRAS 突变的结构是否影响其耐药性诱导作用，我们设计了另一种细胞系，该细胞系以顺式表达激活 KRAS Q61H突变，并带有突变 KRAS G12C等位基因。有趣的是，虽然反式 KRAS Q61H对三个KRAS G12C i 完全不敏感，但顺式KRAS Q61H仅导致 IC50 发生轻微变化。影响药物结合位点的 KRAS 开关 II 口袋突变对三个 KRAS G12C i 表现出不同的影响。KRAS M72I突变削弱了 adagrasib 的活性，但对 sotorasib 和 divarasib 的影响有限。根据这些结果，所有临床观察到的 KRAS M72突变均在服用 adagrasib 的患者中检测到（图1）。KRAS H95L对 sotorasib 高度敏感，但对 adagrasib 和 divarasib 完全耐药，而 KRAS Y96D是唯一对这三种药物完全不敏感的 switch-II 口袋突变。

评估新型 KRAS 抑制剂对各种 RAS/MAPK 抗性改变的影响

为了探索能够克服对 KRAS G12C i 获得性耐药的不同机制的潜在治疗策略，我们在我们的工程细胞系小组中评估了三种新型 (K)RAS 抑制剂：功能不同的 RAS(ON) G12C 选择性三复合物抑制剂 RM-018，其利用丰富的细胞内蛋白环丝氨酸 A 与活化的 GTP 结合 KRAS G12C蛋白形成不可逆的三复合物以抑制下游信号激活；KRAS 选择性抑制剂 Pan KRas-IN-1，旨在靶向多个 KRAS 突变但不影响其他 RAS 亚型（NRAS 和 HRAS）；RAS(ON) 多选择性三复合物抑制剂 RMC-7797，与 RM-018 类似，其利用环丝氨酸 A 与不同的 GTP 结合 RAS 家族蛋白形成高亲和力复合物，从而抑制效应子结合。单一突变对照细胞系中的平均 IC50 分别为 RM-018 0.42 nmol/l、Pan KRas-IN-1 4.46 nmol/l 和 RMC-7977 0.39 nmol/l。RM-018 对所有 KRAS 开关 II 口袋突变均表现出高效力，因为其结合模式不涉及开关 II 口袋，但激活 KRAS、NRAS 和 MAP2K1 突变对该药物不敏感。相反，Pan KRas-IN-1 克服了所有 KRAS 激活突变，但在 KRAS 开关 II 口袋突变中表现出有限的活性。值得注意的是，RMC-7977 对所有 KRAS 和 NRAS 突变都表现出非常高的效力。正如预期的那样，只有 MAP2K1 中的下游突变赋予了抗性。

讨论

突变特异性 KRAS G12C i的临床开发表明 KRAS 突变是可操作的基因靶点，这在该领域引起了极大的轰动。然而，为了最大限度地发挥 KRAS G12C i 的临床益处，必须更深入地了解限制患者获益持续时间的获得性耐药性。通过评估 143 名患者的进展后 cfDNA 的基因组测序数据，本研究以前所未有的规模描述了针对不同临床可用的 KRAS G12C i 的获得性耐药性变异的基因组图谱。我们观察到，在临床耐药时，近 50% 的患者出现了影响 RAS/MAPK 通路的新获得性变异，CRC 的发生率高于 NSCLC。重要的是，我们的临床前数据表明，临床观察到的大多数 KRAS G12C i 获得性耐药改变可以通过新型 (K)RAS 抑制剂（如 RAS(ON) G12C 选择性三复合物抑制剂、KRAS 同工型选择性抑制剂和 RAS(ON) 多选择性三复合物抑制剂）有效靶向。

不同 KRAS G12C i中临床获得性 RAS/MAPK 变异的比例很高，这支持了以下观点：各种靶向和脱靶基因组变异共同导致该途径的重新激活，是导致 KRAS G12C i 耐药的主要驱动因素。我们在分析143名患者的汇总个体患者数据时，观察到超过 50种不同的 RAS/MAPK 变异的高度多样化基因组景观，可细分为五大类：KRAS 基因的获得性扩增或拷贝数增加、KRAS 激酶结构域的激活突变、影响第一代 KRAS G12C i 药物结合位点的 switch-II 口袋突变、NRAS 和 HRAS 亚型的突变以及 RAS 下游的 RAF/MAPK 基因的突变或基因融合。与我们之前在接受 BRAF V600E联合靶向治疗的 mCRC 患者中发现的结果一致，接受 KRAS G12C i 治疗的患者中，很大一部分（尤其是 CRC 患者）表现出异质性耐药特征，多个同时出现的耐药克隆影响不同类型的 RAS/MAPK 通路改变。这凸显了需要能够同时克服多种 RAS/MAPK 耐药性改变的治疗策略，以有效对抗对 KRAS G12C i 的获得性耐药性。

值得注意的是，我们观察到 NSCLC 患者获得性 RAS/MAPK 变异的发生率和多样性显著降低。这可能归因于其他非遗传耐药机制的出现，因为累积证据表明，从腺癌到鳞状细胞癌的组织学转化和上皮间质转化通过诱导 KRAS 独立的细胞状态导致 NSCLC 对 KRAS G12C i 产生耐药性。此外，我们不能完全排除 cfDNA 基因组测序检测在检测疾病负担较低患者的低频变异方面的潜在技术局限性，这可能导致肿瘤类型特异性变异的变异检测率。未来将配对 cfDNA 和肿瘤组织 DNA 测序与转录组学和表观遗传学分析相结合的研究对于揭示对 KRAS G12C i 耐药的遗传和非遗传机制之间的复杂相互作用至关重要。

临床获得性改变的功能验证对于区分真正的耐药驱动因素与耐药克隆中作为旁观者出现的乘客突变至关重要。在这里，我们在工程细胞系中进行了细胞活力测定，以评估各种临床观察到的假定耐药性改变对两种获批的 KRAS G12C i sotorasib 和 adagrasib 以及更有效的 KRAS G12C i divarasib 的影响，后者已经在 NSCLC 和 mCRC 中显示出非常令人鼓舞的非随机疗效数据。重要的是，除在单个患者中检测到的 KRAS Q99L突变外，所有评估的改变都赋予了对三种药物中的至少一种的体外耐药性，为它们的致病性提供了功能证据。有趣的是，影响 KRAS 开关 II 药物结合口袋的突变，特别是 M72I 和 H95L，对三种 KRAS G12C i 表现出不同的影响。事实上，我们小组之前已表明 KRAS G12C i 的异构体选择性受位置 95 上的氨基酸调节，其中 sotorasib 的选择性最低。尽管这三种药物都在 switch-II 口袋中的同一隐蔽凹槽处与突变的 KRAS G12C蛋白结合，但 sotorasib 的独特之处在于它不与 His95 相互作用，这使其对该位置的氨基酸变化不敏感。与这些结构和机制发现一致，在我们的队列中观察到的影响 His95 残基的所有 11 个突变事件都出现在使用 adagrasib 或 divarasib 的患者中。尽管在发生 KRAS switch-II 口袋突变的患者中同时出现的耐药性改变的发生率很高，但这些见解可能有助于指导在选定的患者中顺序使用不同的 KRAS G12C i，直到针对更广泛耐药性改变的新型 KRAS 抑制剂在临床上可用。正如两例患者病例所证明的，cfDNA 的纵向分析提供了一种微创工具，用于监测耐药性和捕获患者的异质性分子肿瘤谱，这有助于合理化靶向治疗的顺序应用。

KRAS 靶向药物领域正在迅速发展，目前有多种药物处于早期临床试验阶段。这些新型 (K)RAS 抑制剂可分为三类：(i) 突变选择性抑制剂，其使用与第一代 KRAS G12C i不同的机制，靶向特定的 KRAS 突变，如 G12C 或 G12D；(ii) 异构体选择性抑制剂，其靶向多个 KRAS 突变，同时保留其他 RAS 异构体，如 NRAS 和 HRAS；(iii) RAS(ON) 多选择性抑制剂，其已在各种 RAS 驱动的癌症模型中表现出临床前活性。在这里，我们评估了每一类药物，以阐明能够克服对 KRAS G12C i的获得性基因组耐药性的异质性谱的潜在治疗策略。我们证明 RAS(ON) G12C 选择性三复合物抑制剂 RM-018 不受 KRAS 开关 II 口袋突变的影响，这要归功于其独特的结合机制，该机制涉及细胞内伴侣蛋白环丝氨酸蛋白酶 A，而环丝氨酸蛋白酶 A 不涉及开关 II 口袋。值得注意的是，相应的在研药物 RMC-6291 已经显示出令人鼓舞的 1 期临床活性数据，在先前接受第一代 KRAS G12C i 治疗的 NSCLC 患者中实现了 50% 的反应率。相比之下，KRAS 选择性抑制剂 Pan KRas-IN-1 虽然对所有 KRAS 激活突变有效，但对开关 II 口袋改变的活性有限，因为它使用与第一代 KRAS G12C i 相同的结合位点。从概念上讲，这两类具有互补活性特征的抑制剂的组合可能在针对不同类型的 KRAS 突变方面提供协同活性。正在进行临床评估的另一种同时针对多个 RAS 突变的方法是使用在研 RAS(ON) 多选择性抑制剂 RMC-6236，RMC-7977 是其代表性临床前工具化合物。在我们的双突变细胞系小组中，RMC-7977 在广泛的 KRAS 和 NRAS 突变模型中表现出皮摩尔至低纳摩尔效力。在 KRAS G12C i 的临床进展中，39% 的患者检测到新获得的 RAS 改变，支持对 RMC-6236 进行临床评估，作为对抗和/或防止耐药性出现的方法。1 期临床试验的初步报告表明，RMC-6236 在携带各种 RAS 突变的晚期实体瘤患者中具有令人鼓舞的临床活性和耐受性。然而，需要更全面、更成熟的临床数据才能充分了解 RMC-6236 的临床疗效和耐受性。我们的功能数据表明，在大约五分之一的 KRAS G12C i 患者中观察到的 RAF/MAPK 基因下游突变可能代表对 RAS(ON) 多选择性三复合物抑制剂的重要耐药机制，可能需要垂直通路抑制的新概念。或者，RMC-6236 与突变型或异构体选择性 KRAS 抑制剂的组合可能是提供临床益处和克服耐药性的替代策略，并且此类组合的临床评估正在进行中。

应该承认本研究有几个局限性。首先，由于元研究设计的原因，不同的基因组测序平台被用于检测整个队列中的获得性变异。为了尽量减少检测偏差，我们仅关注进展后的 cfDNA 测序结果，并将我们的分析限制在所有测序平台涵盖的预定基因列表中。此外，我们排除了原发性疾病进展的患者，以专门探索获得性耐药机制的频率和基因组图谱。其次，尽管考虑了潜在的混杂因素，但我们无法完全排除 KRAS G12C i 在不同肿瘤类型中的分布不均对 CRC 和 NSCLC 患者之间观察到的获得性基因组变异的不同率的潜在影响。需要进一步研究以专门检查接受 sotorasib ± EGFR 抗体治疗的 CRC 患者的基因组耐药性特征，这些患者在我们的队列中代表性不足。此外，我们的基因组测序分析仅限于 cfDNA 的液体活检，在某些情况下，这可能会带来无法诊断的结果的风险，或者在某些 ctDNA 水平较低的患者中，某些低频变异可能低于检测阈值。这可能导致低估获得性耐药变异的普遍性。最后，由于本研究主要关注 RAS-MAPK 通路内的基因组变异，因此需要进一步研究评估 RAS/MAPK 独立或非基因组耐药机制。

尽管如此，我们相信我们的研究结果对于指导临床开发新的、更有效的治疗方法具有重要价值，这些治疗方法不仅针对 KRAS G12C，还针对所有类型的 RAS 突变，有可能使全球约 300 万 RAS 突变癌症患者受益。

结论

总之，这项研究揭示了导致第一代 KRAS G12C i 临床耐药的新兴 RAS/MAPK 通路改变的异质性概况，并强调了使用新型 (K)RAS 抑制剂针对这些耐药机制的潜在治疗策略。