2025年1月23日发表于

Journal of Ovarian Research

摘要

细胞外囊泡或外泌体由每种类型的细胞产生，含有代谢物、蛋白质、脂质和核酸。它们在健康和疾病中的作用是影响细胞生物学的不同方面并充当细胞之间的中介。卵巢颗粒细胞分泌的卵泡液外泌体或细胞外囊泡 (FF-EV) 是卵巢生长和成熟的关键介质。这些外泌体的运动和蛋白质对于调节细胞通讯和细胞衰老（这一过程称为炎症衰老）至关重要。更年期是女性衰老的自然进程，通常伴有多种负面症状和健康问题。它也可能作为更严重健康问题的前兆，包括神经系统、心血管和代谢疾病以及妇科癌症。研究人员发现了揭示外泌体驱动的细胞通讯和卵泡液中卵母细胞发育的多种影响的途径。它还探讨了 FF 外泌体蛋白在与更年期相关的病理中的复杂功能。

介绍

女性生殖周期是多阶段的；它始于月经周期（初潮），终于更年期。在女性胎儿期，初级卵母细胞与其周围的体细胞或颗粒细胞形成“初级卵泡”。在青春期，在促卵泡激素 (FSH) 和黄体生成素 (LH) 等促性腺激素的影响下，一些卵巢卵泡分化为次级卵泡，随后分化为腔前卵泡。这些激素刺激女性生殖激素（雌激素和孕酮）的合成，从而进一步促进卵泡发生和次级生殖特征。最后，由于 LH 突然升高（LH 激增），成熟的卵母细胞会从大的腔前卵泡中释放出来。非促性腺激素抗苗勒氏管激素 (AMH) 也会影响卵泡发育，AMH 可作为卵巢储备减少和卵巢老化的可靠指标。细胞信号传导和生长因子作为卵巢细胞增殖、凋亡和炎症的催化剂，发挥着同样重要的作用。

更年期是指卵巢功能和生育能力的永久性丧失，其特征是女性月经周期不可逆地停止。通常，更年期是在整整一年无月经出血或“闭经”后诊断出来的。这是一个自然的衰老过程，诊断时的平均年龄为 45-56 岁。更年期期间，雌激素和孕激素水平显著下降，导致卵泡丢失或闭锁。35 岁以后，这种情况会显著增加。作为一种调节机制，FSH 分泌增加。因此，更年期女性报告的血清 FSH 激素水平异常（高于 20 IU/mL）和雌二醇或雌激素水平低（低于 20 pg/mL）。随着年龄的增长，卵巢微环境逐渐发生改变，参与细胞增殖和类固醇生成的通路（如 Wnt 和 Notch 通路）可能受到抑制，而抑制通路则占主导地位。多项研究报道了老年女性中 TGF-β、PI3K/Akt 和胰岛素信号的上调。这些通路通过其促凋亡、促炎和抗类固醇生成作用导致生殖衰老。在缺乏雌激素介导的保护的情况下，促炎细胞因子和通路的表达也会增加。氧化应激和炎症增加是导致卵泡退化、DNA 损伤和卵母细胞质量差的主要诱因。这表现为一系列不良的更年期和围绝经期症状，如阴道萎缩、卵巢纤维化、失去排尿控制、潮热、情绪紊乱、抑郁，以及更易患心血管、神经和代谢疾病以及癌症。

颗粒细胞分泌的细胞外囊泡或卵泡液外泌体已被确定为卵巢细胞信号转导和炎症的关键介质。这些亚细胞纳米尺寸的囊泡来自晚期内体，载有蛋白质、脂质和 RNA（siRNA、miRNA、长链非编码 RNA 和 mRNA），它们可通过卵巢卵泡液在体细胞和生殖细胞之间传递，促进细胞内通讯。通过允许各种细胞信号转导和生长因子的交换，并通过 Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、Notch、Hedgehog 和胰岛素信号转导以及 MAPK/ERK 炎症级联，它们刺激细胞增殖和类固醇生成，以及炎症、细胞凋亡和衰老。卵泡液外泌体最初从马卵巢中分离出来，后来来源选择扩展到人类、大鼠、小鼠、牛和猪。它们还与多囊卵巢疾病、原发性卵巢功能不全和癌症等卵巢疾病有关。

卵巢衰老相关实验表明，卵泡液 (FF) 外泌体内容物或货物的改变是导致卵泡闭锁和更年期的原因。与细胞信号转导和细胞凋亡相关的特定 FF 外泌体 miRNA 在老年女性中下调或上调，导致生育能力永久性丧失。卵泡液外泌体的分泌率也随着年龄的增长而增加。这与细胞通路、蛋白质和抗氧化剂生成失调以及卵巢衰老相关的炎症有关。FF 外泌体 miRNA 在卵巢衰老中的诊断和治疗潜力已得到证实；这些 miRNA 调节颗粒细胞增殖以及 Wnt、PI3K/Akt、Notch、胰岛素和 TGF-β 信号转导。然而，外泌体蛋白领域仍然相对未得到开发。外泌体蛋白是外泌体不可替代的组成部分，在外泌体的生物发生、细胞摄取和功能中发挥着重要作用。因此，它们可以证明是各种疾病的关键、可量化指标。在更年期，它们通过各种内吞和信号通路对卵巢颗粒细胞发挥多效性作用。在最近与卵巢功能障碍相关的研究中，它们的作用已被阐明。本综述重点介绍卵泡液外泌体运输和外泌体蛋白在调节细胞信号传导和炎症衰老方面的作用，这些作用会导致更年期相关的病理。

卵泡液外泌体：卵巢功能和衰老的促进因素

细胞外囊泡 (EV) 或外泌体是直径为 30-150 纳米的亚细胞实体，起源于由晚期内体衍生的多泡体 (MVB)。MVB 膜内陷导致囊泡或囊泡形成，其中装载有 RNA、蛋白质和脂质并从细胞中分泌出来。分泌的细胞外囊泡通过依赖网格蛋白或不依赖网格蛋白的途径被受体细胞内吞。外泌体货物对受体细胞的生长、分化和细胞过程具有多种不同的影响。它们与多种疾病有关，例如肥胖和糖尿病等代谢紊乱、神经退行性疾病、癌症和衰老。由于外泌体的生物合成和分泌受个体生活方式选择和生理状态的强烈影响，因此在患病条件下，外泌体货物和数量可能会发生改变。总的来说，外泌体作为治疗剂和诊断标志物表现出巨大的潜力。

卵泡液细胞外囊泡 (FF-EVs) 已从许多哺乳动物的卵泡液中分离出来。通常，会收集牛、猪或马的卵泡液用于研究。从接受体外受精 (IVF) 治疗的雌性中分离大量 FF-EVs 更容易。这是因为患者被注射了 FSH 来促进超排卵。通过抽吸分离混合的卵泡样本中的液体。此后，为了分离外泌体，进行差速离心。该过程可以通过尺寸排阻色谱法和商业化的基于沉淀的试剂盒（如 ExoQuick）来加速。富集后，通过透射电子显微镜 (TEM)、扫描电子显微镜 (SEM)、动态光散射 (DLS) 和纳米颗粒追踪分析 (NTA) 来表征外泌体。人类卵泡液含有各种形状和大小各异的细胞外囊泡。从接受卵胞浆内精子注射治疗的女性中分离 FF-EV 和微囊泡，每毫升卵泡液中可产生 4 x 10 10 个颗粒，大小范围为 10-300 nm。外泌体 RNA 货物可使用实时 PCR 或 RNA 测序进行分析，蛋白质谱可通过质谱法获得。

FF-EVs 及其组成 miRNA 和蛋白质通过卵巢间隙连接和跨区域投射传递，促进卵巢生长和发育。已知人类 FF-EVs 通过其组成 miRNA 调节卵母细胞成熟和卵泡衰老。一项针对猪颗粒细胞的研究表明，FF-EV miRNA 通过 Wnt/β-catenin、PI3K/Akt 和 MAPK/ERK 通路在颗粒细胞增殖、成熟和类固醇生成中发挥作用。多种体外和体内模型已经证实了 FF-EVs 和诊断性外泌体 miRNA 在妇科疾病中的作用，如多囊卵巢综合征 (PCOS) 和原发性卵巢功能不全 (POI)、卵巢癌、子宫内膜异位症和先兆子痫。

FF-EVs 在更年期中起着关键作用，因为它表现出明显的与年龄相关的变化。一项比较研究表明，与年轻、有生育能力的个体相比，老年更年期女性的 FF 外泌体 miRNA 谱发生了改变，FF 外泌体更小且数量增加了一倍。这可能是由于氧化应激和炎症增加所致。凋亡标志物 p53 的上调促进外泌体的组装和分泌。其他细胞机制，如内质网中的蛋白质加工则失调。此外，与 PI3K/Akt、TGF-β、胰岛素、IGF、Wnt 和 Notch 等细胞信号通路相关的 FF-外泌体 miRNA 的上调和下调会导致不孕和衰老。FF-外泌体通过其组成蛋白对卵巢细胞发挥多种作用。外泌体中的一些经典蛋白质包括表面四跨膜蛋白（CD-63、81、82 和 9）、主要组织相容性复合体（MHC I 和 II）、内体分选复合蛋白 (ESCRT)、ALIX（ALG 相互作用蛋白 X）、TSG-101（肿瘤易感基因-101）、肝素硫酸盐、整合素、糖蛋白、外泌体摄取蛋白（洞穴蛋白、网格蛋白、肌动蛋白、动力蛋白）和分泌蛋白（SNARE 和 Rab-GTPases）。此外，外泌体还含有细胞信号传导因子、促炎细胞因子、热休克蛋白（HSP70 和 90）、G 蛋白、细胞骨架蛋白和代谢酶。神经酰胺和浮游蛋白等脂质延伸也能允许外泌体的吸收和分泌。

在牛 FF 外泌体中，已鉴定出近 322 种蛋白质，包括核糖体和热休克蛋白、与内质网相关的蛋白质、补体级联、PI3K/Akt 信号传导和细胞代谢。牛 FF-EV 还通过允许 TNF-α、前列腺素-内过氧化物合酶 2 (Ptgs2) 和五聚蛋白相关蛋白 3 (Ptx3)的表达，促进卵母细胞周围卵丘颗粒细胞的扩增。正常患者和 PCOS 患者之间的比较分析揭示了 3104 种 FF-EV 蛋白，其中 32 种差异表达蛋白参与胆固醇和神经酰胺合成等代谢过程，这些过程对于外泌体的生物合成和摄取以及信号转导至关重要。这些研究表明 FF 外泌体蛋白在卵巢功能中起着关键作用。随着年龄的增长，女性卵巢的代谢途径发生改变；脂质和转移 RNA 合成的增加促进了卵泡液外泌体中应激相关蛋白的产生。本综述重点介绍了几种与更年期相关变化有关的关键应激相关 FF-EV 蛋白。

超越变化：了解更年期相关疾病

进入更年期是一个渐进的过程，可能需要几年时间。绝经后女性更容易患心血管疾病、肾功能障碍、骨质疏松症、糖尿病等代谢紊乱、肥胖症、代谢综合征和妇科癌症。尽管更年期是女性生命中的一个自然阶段，但更年期相关症状和疾病会让生活变得不利。全世界约 85% 的女性会经历至少一种不良的更年期相关症状。最近的一项印度研究报告称，由于心理健康、性和泌尿生殖问题以及更容易患病，绝经后女性的生活质量较差。

遗传和生活方式因素可加速卵巢衰老和不孕。原发性卵巢功能不全 (POI) 或卵巢早衰 (POF) 影响 40 岁以下的女性。她们表现出与更年期和围绝经期女性相似的症状，并表现出更年期激素模式。POI常常与其他疾病同时发生，例如糖尿病、甲状腺相关缺陷、心血管疾病和自身免疫性疾病。多囊卵巢综合征 (PCOS) 的特征是卵泡生长不当、雄激素过多和无排卵，它与更年期有一些共同特征，例如颗粒细胞信号转导失调，卵巢炎症、细胞凋亡和纤维化增加。PCOS 患者的更年期与非疾病状态截然不同。其表现为FSH水平降低和AMH水平升高，使更年期开始时间推迟2年。糖脂代谢受损使PCOS绝经期患者更容易患心血管疾病、代谢紊乱、抑郁焦虑以及子宫内膜癌。潮热、阴道干燥、情绪波动、性欲低下等更年期的一般症状也会更加明显。这使得PCOS女性的更年期过渡和绝经后生活尤为困难。随着PCOS发病率的不断上升，了解PCOS独特的更年期病理生理学变得至关重要。几乎所有女性都会遭受更年期相关问题的困扰，但该领域的研究却少得可怜。因此，有必要明确不良更年期症状背后的生理机制。

更年期相关的细胞信号转导和凋亡途径

这里概述了当前重要信号通路的一般特征，以帮助阐明涉及更年期的关键信号网络的结构。

Wnt/β-catenin通路

在卵巢中，Wnt/β-catenin 信号传导是颗粒细胞增殖和卵巢储备维持所必需的。典型通路涉及 Wnt 配体与其膜受体 Frizzled 和 LRP5/6（脂蛋白受体蛋白）结合，导致 β-catenin 的核转位。在细胞核中，β-catenin 刺激细胞增殖基因的转录。

在小鼠和大鼠中进行的敲除研究证明了 Wnt4/Wnt2 相关通路在颗粒细胞增殖和类固醇生成中的重要性。Wnt-4 的缺失会通过减少卵泡的大小和数量来损害小鼠的生育能力。另一方面，配体的过表达会导致 β-catenin 的活化增加。这对于类固醇生成至关重要，因为 β-catenin 可增强 FSH/cAMP 介导的 CYP19A1（芳香化酶）基因表达，从而产生雌二醇/雌激素。β-catenin 与其下游靶标 StAR（类固醇生成急性调节蛋白）的相互作用对于从胆固醇合成孕酮至关重要。在 Wntless（Wnt 配体转运蛋白）缺陷型小鼠中，观察到卵泡更少、更小、黄体化受损以及孕酮水平低。

毫不奇怪，Wnt 配体及其相关信号蛋白在人类卵巢组织样本中高表达，并且没有与年龄相关的下降。Wnt 通路失调是多囊卵巢疾病 (PCOS)、子宫内膜癌和卵巢癌的常见特征，也与多种更年期症状有关。鉴于其在上皮组织维护中的作用，Wnt/β-catenin 信号传导可以抑制阴道萎缩。通过其在骨细胞增殖和发育中的作用，它可以预防更年期女性的骨量减少等病症，如骨质减少和骨质疏松症。Wnt 2 和 3 在压力条件下也具有抗抑郁性质。

在更年期女性中，卵泡液外泌体分泌增加与卵巢 Wnt 信号抑制相一致。Wnt 信号受神经酰胺依赖性外泌体运输途径调控。在发炎的卵巢中，膜神经酰胺的产生越来越多，它使四跨膜蛋白能够分选到外泌体中。外泌体四跨膜蛋白 CD9 和 CD82 可增加 β-catenin 的外泌体输出，从而降低其核和细胞水平，阻止细胞增殖和类固醇生成。更年期相关的特征，如卵泡衰老和激素分泌减少，都是由于外泌体运输增加导致细胞 β-catenin 减少所致。

TGF-β/SMAD 信号传导

转化生长因子-β (TGF-β) 超家族是一组保守的细胞因子，包括三种人类亚型：TGF-β (TGF-β-1、2、3)、骨形态发生因子 (BMP)、促活素、淋巴结素、抗苗勒氏管激素 (AMH) 和生长分化因子 (GDF)。该途径由受体调节的 SMAD 或 R-SMAD 的磷酸化介导，从而使与细胞生长和凋亡相关的各种基因转录。TGF-β 是上皮细胞中有效的肿瘤抑制因子，通过 p15、p21、p27 和 p57 合成诱导细胞周期停滞，并抑制增殖基因 c-myc。它触发活性氧形成，抑制抗氧化酶，并激活炎症途径。在内皮细胞和间充质细胞中，TGF-β支持增殖和血管生成。

TGF-β 信号在卵巢功能中发挥双重作用，即促进生殖衰老和卵泡发育。虽然 TGF-β 信号通常与卵巢细胞凋亡、炎症和纤维化有关，但 BMP 2、4、15、GDF-9 配体和 AMH 以自分泌或旁分泌的方式促进颗粒细胞增殖。GDF-9 还同时激活抑制性 BMP 拮抗剂 (gremlins) 来调节卵巢细胞生长。BMP-15 的增殖作用被卵泡抑素抵消，卵泡抑素是一种存在于颗粒细胞和卵泡液中的蛋白质（图1）。

图1 颗粒细胞中的 TGF-β 信号传导 – TGF-β 信号传导由外泌体介导，并由 SMAD 促进。TGF-β 配体在整合素、血小板反应蛋白 (TSP) 和激肽释放酶 (KLK) 存在下在早期内体中被激活，这些物质在纤维化和老化的卵巢中含量丰富。TGF-β 配体 GDF-9 和 BMP-15 促进颗粒细胞增殖，并随着年龄的增长而下调，并受到卵泡抑素的抑制。抗苗勒氏管激素 (AMH) 也会随着年龄的增长而下调。因此，抗氧化应激、纤维化、细胞凋亡和外泌体分泌增加

小鼠卵母细胞中的基因表达研究证实，老化样本中 TGF-β 增加。秀丽隐杆线虫卵巢老化模型证实，R-SMAD 中的有害突变可提高卵母细胞质量和生育力、减少 DNA 损伤，从而延缓生殖衰老。健康卵巢中含有丰富的雌激素，它通过体外降解 SMAD 来抑制 TGF-β 信号传导。有趣的是，绝经后女性血清卵泡抑素水平升高，而卵泡液 GDF-9 和 BMP-15 水平下降。绝经后女性 AMH 水平低进一步反映了卵巢储备的减少。

TGF-β 信号传导可能与其他更年期症状有关。绝经后子宫内膜中 TGF-β1 和 TGF-β 受体的过度表达会抑制上皮细胞分化并促进萎缩状况。该通路驱动促纤维化基因的转录、上皮-间质转化和细胞外基质沉积。ROS 生成和 FSH 加剧了这些功能。

TGF-β 受体通过网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用被内化和再循环。此外，小窝蛋白-网格蛋白融合囊泡也将 TGF-β 转运到早期内体中。在更年期，这些内吞途径可能会上调，因为随着 FSH 升高和雌激素和孕酮减少，小窝蛋白合成增加。外泌体介导的 TGF-β 运输比游离 TGF-β 运输更有效。无活性的 TGF-β1 复合物与 LAP (潜伏期相关蛋白) 结合，通过与外泌体硫酸肝素糖蛋白结合而被内化。一旦进入早期内体的酸性环境，TGF-β 就会与外泌体分离并被激活。纤连蛋白和原纤维蛋白促进 LAP-TGF-β1 的细胞沉积，而细胞外基质蛋白（血小板反应蛋白、激肽释放酶和整合素）则诱导 LAP 裂解。这些蛋白质在纤维化卵巢中含量丰富，可在更年期增强外泌体介导的 TGF-β 信号传导。在 PCOS 患者的卵泡液外泌体中，激肽释放酶、血小板反应蛋白和纤维蛋白原过度表达。

卵泡液及其外泌体中存在的几种 miRNA 和长链非编码 RNA 可调节衰老女性的 TGF-β 上调。此外，TGF-β 信号传导和 FSH 分泌通过上调连接蛋白 43 的表达，促进颗粒细胞中缝隙连接的形成。这增加了通过外泌体的卵巢内通讯。相反，增殖性 TGF-β 配体（如 BMP）会下调 Cx43。因此，TGF-β 和外泌体之间的相互作用导致卵巢微环境发生与年龄相关的变化。

Notch信号

Notch 信号是细胞增殖、分化、侵袭、粘附、细胞间相互作用以及凋亡的关键通路。这些过程相关基因的转录由 Delta-Serrate-Lag 2 (DSL) 配体与 Notch 受体（哺乳动物细胞中为 1-4）结合启动，从而导致 Notch 受体胞内结构域 (NICD) 蛋白水解。在卵巢中，Jagged 介导的 Notch 信号通过 Hes/Hey 和 c-Myc 基因转录驱动颗粒细胞增殖，通过 Foxl2 促进分化，通过激活素促进存活。在前颗粒细胞中，增殖性 TGF-β 配体 GDF9 和 BMP15 支持 Notch-2 受体表达，从而加强卵母细胞-颗粒细胞相互作用。对于雌激素合成和黄体细胞存活，Notch 信号进一步诱导 PI3K/Akt 通路。Delta-4信号促进血管生成、卵泡生长和孕酮合成。

Notch 功能障碍在卵巢疾病中很常见，例如 PCOS、卵巢癌和 POF。在 POF 小鼠模型中，生长激素介导的 Notch-1 激活有助于卵母细胞成熟、卵巢组织修复和雌激素合成。同样，在仓鼠卵巢细胞中过表达 lncHOTAIR 会上调 Notch-1，从而减轻 POF 症状。小鼠卵巢中的 RNA 微阵列研究表明，在老年和围绝经期样本中 Notch 配体下调。雌激素受体介导的 Notch 信号转导可保护血管内皮免受 TNF-α 诱导的炎症和细胞凋亡，并改善心肾功能障碍。在中年雌性大鼠中，Notch 通路下调导致慢性应激和抑郁。

外泌体和新型细胞外囊泡 ARMM (含抑制结构域蛋白 1 介导的微囊泡) 已被确定为 Notch 配体和受体的载体。与 TGF-β一样，Notch 通过内吞途径激活涉及酸性内体条件下 γ 分泌酶介导的 NICD 裂解。虽然对外泌体对Notch 信号的调控尚不清楚，但 Notch 抑制剂可在卵巢衰老中发挥重要作用。Numb 是 Notch 的内体抑制剂，可促进 Notch 受体和 DSL 配体的泛素化和溶酶体降解。Numb 在卵巢组织中高表达，其下调导致卵巢癌和子宫内膜异位症中颗粒细胞过度增殖。因此，其在生殖衰老中的作用值得探索。

PI3K/AKT通路

PI3K/Akt/mTOR 信号通路对于细胞存活至关重要，在卵巢功能（如原始卵泡发育、卵母细胞减数分裂、细胞周期和颗粒细胞存活）中起着关键作用。Kit-L（干细胞因子）的激活会触发 PI3K 将 PIP-2 转化为 PIP-3，从而导致 Akt、mTOR 和 FOXO3a 磷酸化。mTOR 促进核糖体蛋白合成和 TGF-β 配体 GDF-9 和 BMP15 的分泌，而 FOXO3a 磷酸化会使 TNF-α、BCl 和 FasL 介导的凋亡途径失活。Akt 通过检查点调节器 Chk1 在 DNA 损伤的情况下允许细胞周期停滞。PI3K/Akt 信号转导由雌激素、胰岛素信号和胰岛素生长因子 (IGF-1) 激活。

最近的研究表明，Akt 的过度表达会对卵巢健康产生负面影响。PTEN（PI3K 拮抗剂）的抑制和 Akt 的过度活化会导致原始卵泡的丢失和 DNA 损伤的增加，这是通过加剧 Ras/Raf/MAPK 信号传导实现的。在 POI 中，PTEN 抑制会阻碍卵泡生长并产生 ROS，而 mTOR 抑制剂则会提高生育能力和卵泡数量。多项动物和人类研究表明，PI3K/Akt 通路与卵巢衰老有关，其中 Akt 和细胞周期检查点的突变会损害 DNA 损伤修复 (DDR) 。

外泌体蛋白是 PI3K 信号转导的主要贡献者。一项针对 PCOS 患者的研究发现，卵泡液外泌体蛋白有 32 种差异表达，其中一些参与 PI3K/Akt 通路。在牛 FF 外泌体中，已鉴定出 13 种对外泌体摄取和 PI3K/Akt 信号转导至关重要的蛋白质：胶原蛋白 α-1 或 COL6A1；热休克蛋白，如 HSP90AA1、HSP90AB1 和 HSP90B1；整合素，如 ITGA2、ITGA6、ITGAV、ITGB1 和 ITGB3；免疫球蛋白重链恒定 Mu 蛋白或 IGHM；Rho GTPase RAC1；玻璃粘连蛋白或 VTN；和信号转导蛋白 YHAQW。Akt 的磷酸化可增加间隙连接蛋白 Cx43 的表达。

葡萄糖代谢和胰岛素信号

葡萄糖是卵巢细胞生长的主要能量底物，低血糖和高血糖都会导致卵巢功能障碍和不孕。在卵泡细胞中，葡萄糖主要通过 AMPK 和己糖胺途径利用。在营养应激（低血糖）下，AMPK 途径可阻止雌激素和孕激素的合成、FSH 介导的细胞增殖，并通过 Akt 促进细胞凋亡。它还刺激促炎性生长因子的产生，例如 TGF-β、TGF-α 和 FGF-2。

最近的研究表明，虽然胰岛素是卵母细胞和颗粒细胞增殖以及类固醇生成所必需的，但高剂量胰岛素会刺激低血糖，不利于卵巢生长。高胰岛素血症小鼠的卵泡发育会停滞。高胰岛素血症和雌激素缺乏会激活 Ras/Raf/ERK 信号，导致许多更年期女性产生胰岛素抵抗、腹部体重增加并易患糖尿病。

胰岛素样生长因子 (IGF) 信号通过 PI3K/Akt和MAPK/ERK 通路模仿胰岛素信号。它对卵巢细胞具有抗凋亡作用并维持卵母细胞质量。它促进 GLUT1（一种葡萄糖转运蛋白）的表达，从而促进葡萄糖的吸收。卵巢分泌 IGF-1 受生长激素或生长激素的刺激，而生长激素会随着年龄的增长而下调。许多 POI 和 PCOS 的治疗干预措施涉及 GH 的使用。在绝经后萎缩的子宫内膜中，IGF-1 表达受到抑制。老年女性血清中 IGF- 1水平降低与骨密度降低和骨质疏松性骨折风险增加同时存在（图2）。

图2 胰岛素信号促进炎症 Ras/MAPK 信号和 PI3K/Akt 信号。通过 Akt 的表达，它在监测氧化应激、细胞存活、细胞周期调控、芳香酶表达、核糖体蛋白质生成和糖原合成中发挥作用。外泌体分泌增加和炎症会促进胰岛素信号，并可能对颗粒细胞健康产生负面影响

卵泡液外泌体介导葡萄糖吸收和胰岛素信号传导。与 IGF-1、MAPK 和 PTEN 相关的外泌体基因与卵巢储备减少有关。猪 FF 外泌体 miRNA 抑制肿瘤抑制因子 BTG2，通过胰岛素信号传导和 Akt 促进细胞存活。在 PCOS 中，外泌体 DENND1A.V2 蛋白升高会促进胰岛素和 MAPK 信号传导，导致胰岛素抵抗和不孕。DENND1A 是 Rab35 的鸟嘌呤核苷酸交换因子，因此促进外泌体的吸收。虽然它与 PCOS 有关，但它在更年期中的作用仍未得到探索。

Hedgehog通路

在哺乳动物中，Hedgehog信号（Hh）涉及三种配体，即音猬因子（Shh）、沙漠猬因子（Dhh）和印度猬因子（Ihh），它们与跨膜受体Patched（PTCH）1和2结合，从而使跨膜受体Smoothened（SMO）活性以及Gli1、2和3及相关基因的转。在果蝇卵巢中，Hedgehog信号促进颗粒细胞增殖。它促进哺乳动物卵泡和卵母细胞的发育和成熟以及孕酮合成。在牛卵巢卵泡中，芳香化酶基因（CYP19A1）的表达随着Ihh和PTCH1的表达而增加。

CREB（cAMP 反应元件结合蛋白）是一种关键的增殖基因，在雌激素合成中起重要作用。在 IGF-1 的影响下，FSH 受体诱导高水平的 cAMP，从而使 CREB 激活芳香化酶基因中的 CRE（cAMP 反应元件）启动子。秀丽隐杆线虫卵巢模型显示，TGF-β/Smad 通路下调会降低 CREB 表达，引发 Hedgehog 配体表达的补偿性增加，以维持卵母细胞质量并延缓生殖衰老。随着与衰老相关的 TGF-β 上调，Hedgehog 信号传导减弱。然而，Hedgehog 信号在衰老过程中的确切机制尚不完全清楚。虽然来自各种组织的外泌体携带 Hedgehog 配体，但该通路对外泌体分泌的影响尚不明确。

p53通路

P53 或 TP53（肿瘤蛋白 53）是一种促凋亡细胞标志物，通常与癌症进展有关。它主要参与 G1/S 检查点的细胞周期调节和 DNA 损伤修复。它激活细胞周期抑制剂 p21 和视网膜母细胞瘤，同时抑制细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶。p53 通过 Fas-L 和线粒体细胞死亡级联启动细胞凋亡。在衰老卵巢中，p53 因 ROS 生成增加、炎症和 DNA 损伤而被激活。随后，它会诱导凋亡和自噬途径，并拮抗 IGF-1/PI3K/Akt/mTOR 介导的细胞存活。p53激活AMPK 信号以缓解营养压力，阻碍类固醇生成和细胞增殖。

目前已知 p53 对于外泌体的分泌非常重要。它调节内吞蛋白的表达，例如 TSAP6 (肿瘤抑制相关通路 6)、Chmp4C (带电多泡体蛋白4C) 和 Caveolin-1。Caveolin-1 对于小窝的组成至关重要，而小窝可介导外泌体对各种生长因子的摄取，例如 Notch、TGF-β、IGF-β 和 EGFR (表皮生长因子蛋白)。Chmp4C 是 ESCRT-3 复合物的组成部分，对于蛋白质分选、MVB 生物合成和囊泡形成都很重要。TSAP-6 是一种存在于内体、囊泡和质膜上的通道蛋白，可促进外泌体在 DNA 损伤和氧化应激后分泌。在小鼠中，TSAP-6 的缺失会损害外泌体的分泌。与正常对照相比，更年期女性中与 p53 通路相关的几种 miRNA 表达存在差异。因此，p53 通路可能与更年期观察到的 FF 外泌体数量增加有关。

卵巢老化：炎症加重的结果

生殖功能受炎症影响，排卵本身就是一个炎症过程。LH 激增会触发卵泡破裂，并促使卵巢细胞释放促炎细胞因子。这会激活多种信号通路，包括 PI3K/Akt、PKC、PKA 和 MAPK/ERK，从而促进类固醇生成、前列腺素合成，并增加 ROS 生成，导致卵泡壁降解。

然而，雌激素减少引起的慢性炎症会加速衰老。绝经前，17-β 雌二醇（雌激素）通过允许线粒体雌激素受体持续表达来抑制线粒体 ROS 的形成。随着年龄的增长，涉及 NF-κB、NLRP3 炎症小体、caspase-1、IL-1β 和 TNF-α 的炎症级联越来越活跃。卵巢组织中 ROS 相关损伤会导致卵泡闭锁、卵巢细胞凋亡、类固醇生成受损和血管生成异常。ROS 会触发促炎细胞因子（如 TNF-α、IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-18 和 IL-2）和趋化因子的产生，这些因子在衰老女性的血清和卵泡液以及衰老小鼠的卵巢中会升高（图3）。

图3 外泌体分泌与卵巢炎症相互关联；卵泡液外泌体货物刺激 NF-κB/NLRP 信号传导和促炎细胞因子，如 IL-18、IL-1β 和 TNF-α。NLRP 炎症小体由外泌体运送，因此外泌体分泌增加。雌激素减少引起的氧化应激会促进炎症和纤维化。抗氧化剂抑制外泌体分泌。

FOXO 蛋白可感知氧化应激升高，从而刺激抗氧化剂释放或 Fas-L 介导的细胞凋亡。抗氧化剂 Sirtuin-1 可激活 FOXO 并诱导线粒体生物合成。雌激素和 AMH 水平降低时，其表达下调。体外敲低 SIRT-1 和 SIRT-2 可形成更大的 MVB，并增加外泌体分泌。Nrf2（核因子 E2 相关因子）通路也是抵御 ROS 的重要防御手段。

细胞外囊泡维持卵巢炎症衰老——随着雌激素水平下降，卵巢细胞越来越多地分泌携带 NLRP 炎症小体的 EV。炎症小体还刺激 EV 分泌，以传递 NLRP/caspase-1 级联的促炎效应物，例如 IL。钙内流可诱导炎症小体和外泌体的分泌。为了应对炎症，外泌体使卵巢巨噬细胞从 M1 表型极化为 M2，从而引发促纤维化因子的分泌，例如 IL-3、IL-4 和 TGF-β。

在 PCOS 中，炎症卵泡液外泌体蛋白增加了很多倍。这些包括氧化应激和炎症的标志物，例如 S100A9、S100A8、过氧化物酶 (PRDX6，一种抗氧化酶)、C 反应蛋白 (CRP)、d-多巴铬脱羧酶 (DDT)、视网膜脱氢酶 1 (ALDH1A1)、血管紧张素原、TNF-α 和激肽原 1 (KNG1)。当用富含 S100A9 的 FF 外泌体处理卵巢细胞时，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 和趋化因子的水平显著增加，而芳香化酶基因 (CYP19A1) 的表达受到抑制。S100A9 和 S100A8 通过 NFκB 激活炎症细胞因子级联。S100A8/A9 在老年、多产小鼠卵巢中上调，而在衰老的人类卵巢组织中过表达。

慢性卵巢炎症状态是许多更年期相关症状的病因。外泌体将卵巢炎症小体运送到各个器官，导致心血管疾病和肾脏疾病、代谢紊乱、骨骼疾病和神经炎症。中枢神经系统活动中断会导致情绪障碍并损害记忆力和认知能力。NF-κB 信号通过 NFκB 受体激活剂 (RANKL) 激活骨吸收破骨细胞，从而导致骨质疏松症等骨骼疾病。响应 NF-κB/NLRP-3 信号，一氧化氮 (NO) 诱导抗炎热休克蛋白 70 (HSP-70)，以防止与热相关的细胞损伤。更年期期间出现的潮热或血管舒缩症状是由于一氧化氮介导的抗炎反应引起的。HSP-70 是一种常见的外泌体蛋白，其表达随着年龄的增长和 Sirtuin 水平的降低而减少。与 FF-外泌体蛋白相关的炎症和氧化应激可驱动癌变和肿瘤生长，导致妇科癌症。

表1总结了参与更年期相关细胞信号传导和炎症途径的关键卵泡液外泌体蛋白，强调了它们在此转变过程中调节细胞过程的潜在作用。

结论

卵泡液外泌体是卵巢细胞信号传导的关键诱导物。由于外泌体是细胞分泌蛋白质的一种方式，因此它们富含可启动受体细胞信号转导的蛋白质介质。外泌体蛋白受到保护，不会发生细胞降解，因此数量丰富。本综述讨论了卵泡液外泌体蛋白在卵巢衰老和炎症中的多方面作用。在更年期，由于炎症和氧化应激增加，卵泡液外泌体分泌显著增加。这是由于 TGF-β 和 p53 以及 PI3K/Akt 和胰岛素信号的激活。促进颗粒细胞增殖和类固醇生成的途径，如 Wnt/β-catenin 和 Notch 信号，会衰退。对各种体内和体外研究的调查有助于确定与这些特定途径相关的特定 FF 外泌体蛋白。外泌体也与更年期的不良症状有关。

外泌体是有希望的治疗剂

虽然激素疗法仍然是治疗更年期最常见的干预措施，但其长期副作用令人担忧。二甲双胍（一种抗糖尿病和抗炎药物）和白藜芦醇（一种抗氧化剂）等替代品显示出潜力，但在高剂量时可能会产生不良影响。使用外泌体作为药物递送载体提供了一种低剂量和有针对性的方法。虽然目前的卵巢再生疗法涉及间充质干细胞外泌体，但未来可能会设计出基于FF外泌体的疗法。正如注射来自年轻血浆的EVs可以减轻与衰老相关的功能障碍一样，来自年轻卵泡液的EVs可能有助于逆转与更年期相关的不良影响。在一项研究中，卵泡液外泌体miRNA减轻了与衰老相关的氧化应激。此类干预措施对围绝经期女性尤其有益。许多外泌体蛋白已被提议作为卵巢癌、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征和先兆子痫的诊断生物标志物，并且可以通过高灵敏度检测试验在卵巢液中检测到。通过进一步研究，我们可能能够确定特定卵泡液外泌体蛋白在卵巢衰老和更年期相关症状中的作用，并确定它们的诊断潜力。