2023年5月8日发表于Cancer Cell International

摘要

如今，癌症治疗是全球临床医生和研究人员面临的基本问题之一。人们一直在努力寻找一种治疗这种疾病的极佳方法，新的治疗策略也在迅速发展。过继细胞疗法 (ACT) 是一种实用的方法，可以改善癌症患者的临床结果。在 ACT 中，武装免疫细胞对抗肿瘤的最佳方法之一是通过基因工程使用嵌合抗原受体 (CAR)。CAR 使细胞能够靶向肿瘤细胞上的特定抗原并选择性地消灭它们。研究人员通过使用 CAR，在不同细胞上取得了有希望的临床前和临床结果。似乎适合 CAR 免疫细胞疗法的强效免疫细胞之一是自然杀伤 T (NKT) 细胞。NKT 细胞具有多种特性，使其成为对抗肿瘤的强效细胞，可以成为 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞的有力替代品。NKT 细胞是具有多种功能的细胞毒性免疫细胞，对正常细胞没有明显的副作用。本研究旨在全面提供癌症CAR-NKT细胞治疗的最新进展。

介绍

近期，嵌合抗原受体 (CAR) 装甲细胞疗法集中于 T 细胞。这种细胞已表现出对抗不同肿瘤的出色能力，并能对其进行适当治疗，尤其是在血液系统恶性肿瘤中。迄今为止，FDA 批准的六种基于 CAR-T 细胞的药物已用于治疗血液系统恶性肿瘤，包括 Kymriah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、Abecma 和 Carvykti。与其优异的优势不同，它们有一些副作用和每剂高昂的成本，限制了它们在临床上的使用。科学家们继续探索寻找其他潜在的免疫细胞作为基于 CAR 的细胞治疗候选者。有用的细胞候选者之一是 NKT 细胞，它是先天免疫系统的一个子集，构成循环细胞。NKT 细胞通过产生不同的生物因子来连接先天免疫系统和适应性免疫系统，被认为是针对肿瘤的强效细胞毒性细胞。

在疾病过程中，NKT 细胞在调节免疫系统和抑制肿瘤微环境 (TME) 方面起着至关重要的作用。此外，NKT 细胞具有增强的细胞溶解活性和良好的 TME 浸润能力，这使肿瘤细胞靶向性很强。NKT 细胞具有一些出色的特性，使它们成为非常有用的抗肿瘤细胞，包括双重功能能力（利用先天受体和工程受体进行激活的能力）、MHC 独立的细胞毒性、成功进行“现成”过程（创建新修饰细胞的能力速度），以及在无能过程中提高的抗肿瘤免疫力。NKT 细胞的一些天然特性使它们成为强有力的候选细胞，例如，快速检测和根除肿瘤、在细胞生长早期消除癌细胞以及即使在免疫系统失能期间也能对抗肿瘤。NKT 细胞可通过产生白细胞介素 2 (IL-2) 和 IL-21 来激活其他免疫细胞，从而激活 NK 细胞和 T 细胞。当 CAR 结构添加到 NKT 细胞中时，可产生具有不同细胞毒性特征的强大细胞，对抗癌症。

本研究旨在全面讨论CAR-NKT细胞疗法的各个方面及其在癌症治疗中的最新进展。详细讨论了这种治疗方法的不同优势、与其他CAR装甲免疫细胞的比较以及癌症CAR-NKT细胞疗法的相关临床前和临床发现。此外，还讨论了提高CAR-NKT细胞治疗安全性和有效性的局限性、挑战和解决方案，以得出CAR-NKT细胞是否可用于癌症治疗的结论。

NKT细胞

类型和结构

NKT 细胞分为三种类型，每一种都有表 1所列的显著特性。最著名的 NKT 细胞类型是 I 型，即恒定 NKT（iNKT）细胞。这种细胞仅限于 T 细胞受体（TCR），由于 TCR 来源有限，因此表达半恒定的 TCR-α 链。由于 iNKT 细胞继续表达依赖于 T 细胞成熟的因子，如 CD4 和 CD8，所以这种细胞类型又分为三种亚型：CD8+、CD4+和双阴性（CD4−  CD8−或 DN）细胞。CD8 +和 DN 细胞类型可以产生 Th1 细胞因子，而 IL-4 和 IL-13 等 Th2 细胞因子的产生是 CD4 +细胞类型所独有的。CD4 +细胞被认为是辅助细胞或调节细胞，而 CD8 +和 DN 细胞被认为是具有细胞毒特性的效应细胞。在这些类型中，CD8+细胞具有更强的细胞毒功能，并显示出细胞毒性细胞相关受体（如 CD16、NKG2C 和 NKG2D）表达上调。所有这些细胞的代表受体都是 α-半乳糖神经酰胺 (α-GalCer)。这些亚型在细胞因子分泌谱以及趋化因子受体、整合素和浅表受体的表达方面有所不同。II 型 NKT 细胞可通过激活 TME 中的髓系抑制细胞 (MDSC) 和肿瘤相关因子来增强癌症。由于这种类型没有特定的标记或激动剂抗原，因此其分类具有不同的挑战。这些细胞具有更多样化的 Va 重排，如 TRAV7、TRAV9 和 TRAV12，这使得它们能够轻松识别硫苷脂配体，如溶血磷脂酰胆碱。抑制这些细胞类型可能会改善效应 NKT 细胞在癌症治疗过程中的功能。

表1 NKT 细胞三种主要亚型的比较

激活和功能

NKT 细胞以不同的方式被激活：（1）与 T 细胞一样，通过 TCR 和 CD1d 识别；（2）与 NK 细胞一样，通过表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (KIR) 和自然杀伤细胞受体 (NLR)；（3）通过细胞因子如 IL-12、IL-18 和干扰素-γ (IFN-γ)。NKT 细胞中的细胞毒性和细胞因子反应量取决于糖脂抗原、NKT 细胞亚型和 NKT 细胞的组织位置等因素。α-GalCer 是在一种名为 Agelas mauritianus 的海绵中发现的一种合成糖脂，可以与 TCR 和其他受体结合。α-半乳糖神经酰胺 (α-GalCer) 配体通过与抗原呈递细胞 (APC) 上的 CD1d 受体结合来激活 NKT 细胞。α-GalCer 激活 NKT 细胞具有一些优势，包括修复 TME 中的 NK 细胞和 T 细胞并招募其针对 CD1d +肿瘤细胞的能力、快速分泌多种细胞因子以及双重影响功能。

尽管 α-GalCer 对 NKT 细胞具有强效的抗肿瘤作用，但重复使用会导致细胞无能。因此，α-GalCer 的慢性激活会下调 TCR 和 NLR 的表达，增加程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1) 和 B 和 T 淋巴细胞衰减因子 (BTLA) 等抑制分子的表达，终止活化诱导的细胞死亡过程 (AICD)，减少无能细胞中 IFN-γ 的产生和 IFN-c mRNA 的表达，增加 IL-4 mRNA 的表达，并诱导 iNKT 细胞向 Th2 和 T reg细胞转变。这是 NKT 细胞用来防止组织损伤的一种自调节机制，但在癌症患者中，它会导致肿瘤细胞免疫逃逸。

另一个重要的联系因素是 CD1d 受体，它是一种非多态性的、糖脂呈递类型的 MHC 1 类样细胞，在 APC 和胸腺细胞中表达。CD1 家族分为几组，其中 CD1d 广泛表达于不同的癌症中。NKT 细胞可通过识别肿瘤细胞上的 CD1d 特异性抗原直接杀死 CD1d +肿瘤；然而，CD1d -肿瘤的清除是由其他免疫细胞（如 NK 细胞和 T 细胞）介导的。

NKT 细胞无需依赖 MHC 即可杀死肿瘤细胞，而是间接地通过激活 CD8 +细胞来攻击 MHC +肿瘤细胞。此外，NKT 细胞诱导肿瘤细胞死亡的其他作用包括刺激 CD1d、激活细胞死亡受体、诱导穿孔素、颗粒酶 B 和肿瘤坏死因子 a 相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 的产生。另一个亮点是 NKT 细胞和 DC 之间的通讯。在晚期癌症中，DC 细胞不能激活 NKT 细胞，但可以表达 α-GalCer 抗原。NKT 细胞通过影响 α-GalCer、增强免疫系统对癌细胞的反应以及介导 TCR 与 CD1d 以及 CD40L 与 CD40 之间的相互作用来激活 DC 细胞。一方面，活化的DC细胞可以产生IL-12并增加IFN-γ水平，进而激活NK细胞、NKT细胞和T细胞。此外，DC细胞表达CD27L、CD70和NKG2DL，这会增加NKT细胞的细胞毒性。另一方面，NKT细胞可以通过激活CD8α +  DC细胞并吸引CD8 +细胞至肿瘤部位来刺激CC基序趋化因子配体17（CCL17）的分泌。

NKT 细胞分泌大量细胞因子和趋化因子，例如受正常 T 细胞激活调控并可能分泌的细胞因子 (RANTES)、Eoxtaxin 和巨噬细胞炎症蛋白-1a (MIP-1a)。这些趋化因子可改善免疫细胞的功能并将它们吸引到 TME。NKT 细胞还通过抑制 TME 中的免疫抑制细胞来促进免疫系统的功能。例如，I 型 NKT 细胞可通过抑制肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)（一种加速肿瘤进展的免疫抑制剂）来介导原发性人类神经母细胞瘤中的抗肿瘤活性。此外，据报道，在甲型流感病毒模型中，I 型 NKT 细胞可抑制来自髓系群体的免疫抑制细胞 MDSC。

比较

从表型上看，NKT 细胞与传统 T 细胞具有共同的标志物，如 TCR、CD4 和 CD8，以及与 NK 细胞共同的标志物，如 KN1.1、CD16 和 CD56。与传统 T 细胞不同，NKT 细胞表达有限范围的 TCR-α 和 β 链，并识别 APC 细胞上的 CD1d 而不是 MHC。与 NK 细胞不同，NKT 细胞获得功能特性，如在成熟过程中产生细胞因子并在抗原暴露期间快速作出反应。与传统效应 T 细胞一样，NKT 细胞分为三种类型（NKT-1、2 和 17），并产生相关细胞因子，如 IFN-γ、IL-4 和 IL-17。通常，NKT 细胞有三组受体，包括 CD1d、半 I TCR-β 链和 iTCR。NKT 细胞通过 CD1d 和细胞因子分泌来调节免疫系统，但 T 细胞和 NK 细胞仅通过细胞因子分泌来调节免疫系统。有趣的是，由于 CD1d 在整个身体中广泛表达，NKT 细胞可以比其他免疫细胞更好地调节免疫反应。

NKT 细胞和 T 细胞均由双阳性 αβ T 细胞通过不同的胸腺选择而衍生，且具有相似的成熟过程。然而，除了用胸腺上皮细胞选择的 T 细胞外，NKT 细胞均从表达 CD1d 的双阳性（CD4 + CD8 +或 DP）胸腺细胞中选择。另一个区别是 T 细胞是细胞免疫系统的成员，具有更强的细胞毒性，而 NKT 细胞是先天免疫系统的一部分。此外，T 细胞的转染能力优于 NKT 细胞。然而，NKT 细胞比 T 细胞具有更多与趋化因子相关的基因，这表明 NKT 细胞可能通过改善趋化因子相关的相互作用来功能性地调节免疫系统。

NKT 细胞和 NK 细胞相比，NKT 细胞属于 T 细胞，而 NK 细胞属于大颗粒淋巴细胞。此外，NKT 细胞成熟发生在胸腺中，具有 TCR，而 NK 细胞成熟大多发生在血液循环中，具有 F c受体以及激活性和抑制性受体。NKT 细胞和 NK 细胞是参与 TME 防御反应的一线细胞。此外，NK 细胞和 NKT 细胞的 CAR 结构可与细胞内信号传导一起使用，但 T 细胞不能同时使用这两种信号传导方式。在最后一种情况下，NKT 细胞不含有细胞质颗粒，而 NK 细胞含有细胞质颗粒。

CAR-NKT 细胞，癌症免疫治疗的有力推动者

由于一些障碍，如 NKT 细胞频率低、TME 浸润不足以及 CD1d- 肿瘤细胞群占大多数， NKT 细胞无法在癌症治疗中发挥有效作用。尽管如此，由于 NKT 细胞的完美特性以及可接受的基因工程改造使其变得强大，将 NKT 细胞与 CAR 结构相结合可以产生强效的效应细胞，可在癌症治疗中产生有希望的结果。

CAR结构使免疫细胞能够选择性地对特异性抗原作出反应，调节装甲细胞的活化，并提供MHC独立的抗原识别。CAR为识别多种抗原（如糖基化蛋白、糖脂、碳水化合物和构象表位）铺平了道路。

CAR结构从外到内由三部分组成：胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域部分负责由单链可变区段（ScFv）结构介导的抗原识别。ScFv通过间隔区（铰链区）与跨膜部分相连，是胞外结构域部分最常见的结构。其亲和力影响CAR结构的特异性。间隔区在CAR的特异性中也起着至关重要的作用。较短的铰链具有更好的抗肿瘤功能，而较长的间隔区似乎更有效地靶向远端膜细胞中的抗原。

跨膜结构域将结构固定在膜中，传递信号，可包含不同的分子，如 CD3ζ、CD4、CD8 和 CD28。胞内结构域部分负责刺激 CAR 免疫细胞。CAR 的胞内结构域包括 CD3ζ，它在信号传递中发挥作用。胞内结构域中存在的共刺激结构域（如 4-1BB、CD27、CD28 或 OX40）有助于增强 CAR 的细胞溶解功能、细胞因子产生和持久性。NKT 细胞没有特殊的共受体；相反，CD4 分子作为共受体发挥作用。CAR 的功能取决于胞内结构域部分，该部分的任何变化都可能刺激各种信号级联并产生针对靶抗原的不同反应。一些关于 CAR-NKT 细胞共刺激物功能的研究在这些细胞中显示出不准确的结果。例如，与 CAR-T 细胞不同，在 CAR-NKT 细胞中，CD28 有利于增殖、肿瘤杀伤功能和存活。此外，CD28 促使 CAR-NKT 细胞大量扩增，而 4-1BB 诱导过度激活并使其重新定向为细胞死亡。

根据有效分子结构和共刺激分子存在与否，CAR结构分为五代（图1）。第一代由ScFv和CD3ζ组成，不含共刺激物。第二代和第三代CAR除了ScFv和CD3ζ外，分别含有一种和两种共刺激分子（4-1BB、CD27或OX40）。第四代CAR称为定向通用细胞因子杀伤T细胞（TRUCK），是通过转导转基因来分泌细胞因子（如IL-12）或其他生物因子而设计的。这类CAR包含活化T细胞的核因子（NFAT），可使细胞分泌细胞因子。TRUCK在癌症治疗中已显示出极好的临床前和临床结果。第五代CAR-T最近问世，它具有额外的共刺激结构域来激活新的信号通路。在这种结构中，共刺激物被添加到与STAT和CD27结构域连接的细胞因子受体（例如IL2Rβ链片段）的胞内结构域中。凭借这种新结构，CAR-T细胞可以诱导抗原依赖性的JAK-STAT通路激活，改善细胞增殖，并防止终末分化。此外，与前几代相比，这种结构在白血病的持久性和治疗效果方面表现出更好的效果。

图1 A. CAR结构的不同世代。基础结构包括胞外域、跨膜域和CD3ζ，所有世代均有这些结构。主要差异与共刺激域和相关的信号级联有关。结构各部分的变化可以产生具有不同特征的新型CAR。B. CAR结构装甲NKT 细胞的功能。NKT细胞可以利用CAR识别、先天激活受体识别和“双功能”的相关性来更好地发挥抗癌细胞毒性。

通过将CAR结构导入NKT细胞，CAR-NKT细胞被创建为一种新型基因工程细胞，它具有不同的能力，可以对癌细胞产生不同的影响。图2显示了这些细胞对抗肿瘤的各种作用。CAR-NKT细胞可以通过其先天受体的直接机制摧毁肿瘤细胞，也可以间接影响其他免疫细胞，这是由于CAR结构特异性增强所致。有趣的是，CAR-NKT细胞通过调节免疫系统、抑制某些免疫抑制细胞和增强细胞免疫反应，在癌症治疗中发挥着重要作用。与CAR-T细胞一样，CAR-NKT细胞在功能性、体外和体内研究中在治疗非实体肿瘤方面取得了令人鼓舞的结果。然而，由于CAR-NKT细胞具有独特的特点，例如在TME中浸润细胞多且无反应性低，因此在实体瘤中表现更为突出。CAR-NKT 细胞治疗实体肿瘤的报道已取得良好结果。

图2 CAR-NKT 细胞与其他免疫细胞和肿瘤细胞的不同相互作用。CAR-NKT 细胞可以通过各种方法调节免疫系统，并通过或不通过 CAR 来溶解肿瘤。此外，CAR-NKT 细胞可以激活其他免疫细胞，如 CD8 细胞、CD4 细胞和 NK 细胞以及巨噬细胞。例如，CAR-NKT 细胞可以将免疫抑制巨噬细胞转变为免疫刺激巨噬细胞，并通过增加穿孔素和颗粒酶 B 来改善肿瘤根除。

此外，CAR-NKT 细胞不会产生显著的副作用，其安全性之前已得到证实。CAR-NKT 细胞的另一个显著优势是其最终价格低廉（由于其复杂性有限）、重复给药的需要低、由于 MHC 独立性而无个人依赖性，以及移植物抗宿主病 (GVHD) 毒性的发生率有限。到目前为止，已经开发了第二代和第三代 CAR-NKT 细胞。另一个好处是，还已证明 CAR-NKT 细胞结构的微小改变（如共刺激分子的变化）会导致细胞因子分泌谱的变化。因此，由于可以获得各种 CAR 结构，CAR-NKT 细胞可以在癌症治疗中发挥广泛的功能。因此，CAR-NKT 细胞可以被推荐为癌症的强效治疗细胞，其有效能力可以对未来癌症治疗的成功产生积极影响。

CAR-NKT 细胞制造

CAR-NKT 细胞制造过程与 CAR-T 细胞和 CAR-NK 细胞类似，但有一些区别。制造过程包括细胞收集、激活、扩增、转导（将 CAR 基因递送到细胞中）以及将 CAR-NKT 细胞通过静脉或肿瘤内回输到患者体内。

为了获得细胞来源，可以分别从癌症患者和健康个体中收集自体和同种异体 NKT 细胞。NKT 细胞来源不同，特点各异。例如，造血干细胞工程化 iNKT 细胞 (HSC-iNKT) 可以有效治疗小鼠模型中的血液系统癌症。它们可以从脐带血 (UCB)、骨髓 (BM) 和 PBMCs 中收集。HSC-iNKT 细胞是工程化 CAR-NKT 细胞的有希望的来源，可为对高剂量化疗和放疗有耐药性的患者提供有效治疗。再例如，HSC 细胞是生产高纯度、高效率的人类同种异体 HSC 工程化 iNKT 细胞 ( Allo HSC-iNKT) 的极佳来源，可以用 CAR 结构进行工程化。异体HSC-iNKT 细胞是现成 CAR 的良好候选者，因为它们没有显著毒性，而且由于其独特特性，它们可以抵抗异体排斥。此外，制造 HLA 消融的通用 HSC-iNKT 细胞及其衍生物（如 CAR-iNKT 细胞）可以提高这些细胞在体内的持久性和抗肿瘤功能。

由于外周血循环中的 NKT 细胞数量很少，因此细胞分离和扩增过程至关重要。可以使用不同的方法来扩增 NKT 细胞。从不同来源收集 NKT 细胞可能有效；例如，来自 PBMCs 的 NKT 细胞呈现更多的 α-GalCer 和 IL-2 激动剂。Exley 等人提出了一种依赖于细胞选择的方法，该方法基于与人类 CD1d 不变 T 细胞 (mAb6B11) 反应的多克隆和单克隆抗体 (mAb)，然后通过 APC CD1d +细胞用糖脂化合物激活和扩增。他们成功地使用了非特异性有丝分裂原（如激活性抗 CD3 mAb），并在 2-3 周内建立了细胞系。尽管如此，它们的应用仅限于基于前几轮由 α-GalCer CD1d 增殖的克隆来制备高纯度 NKT 细胞。

激活后，CAR基因转导到NKT细胞中需要借助生长因子和载体。目前，CAR-NKT细胞的分离、转导和扩增经验有限，需要更多研究。该领域的一个重要配体是CD62L，它能诱导CAR-NKT细胞扩增。CD62L +细胞和CD62L -细胞在细胞溶解功能和细胞因子分泌方面没有差异，但在持久性和增殖方面有所不同。此外，IL-21可以选择性保护CD62L + NKT细胞并改善其在CAR免疫治疗中的功能。IL-21选择性地抑制CD62L +细胞中BIM（促凋亡因子）的表达，而不影响BCL2（抗凋亡因子）的表达，并保护细胞免受AICD的侵害。Karadimitris等人。优化了一种方案，该方案可大幅扩增来自所有来源的CAR-19 工程 NKT 细胞，这些细胞可在现成的环境中用于对抗表达 CD1d + /CD19 +的淋巴组织。在自体 APC 和 IL-15 存在下，NKT 细胞的前期扩增和 CD3/CD28 激活的 NKT 细胞的慢病毒转导建立了活性细胞源。Simon 等人从健康供体的 PBMC 中获取 NKT 细胞和 CD8 + T 细胞，并用 OKT-3 和 IL-2 刺激该细胞群。他们检测到这两种细胞系都扩增良好，但 NKT 细胞的百分比低于 CD8 + T 细胞。无论如何，CAR-NKT 细胞的制造需要更多的经验和时间来寻找新方法和更好的加工方法。然而，现有方法比 CAR-T 细胞生产具有更多的现成潜力和更低的成本。

CAR-NKT 细胞、CAR-T 细胞和 CAR-NK 细胞在癌症免疫治疗中的比较

与CAR-T细胞和CAR-NK细胞相比，CAR-NKT细胞具有多种优势，并已被引入作为一种更好的癌症治疗方法。基于此，对上述CAR免疫细胞的各个方面进行了全面的比较，这些细胞已列于表2中。尽管使用CAR-T细胞治疗癌症的结果令人鼓舞，但这种治疗的副作用是一个持续存在的问题。CAR-T细胞有不同的副作用，有时会导致患者死亡，并给医疗保健系统和患者带来高昂的成本负担。有趣的是，大多数研究报告称CAR-NKT细胞没有明显的副作用，并建议使用CAR-NKT细胞治疗是安全的。与CAR-NK细胞疗法相关的报告不良反应也很少见。在一份病例报告中，非小细胞肺癌患者在接受CAR-NK细胞治疗后报告了严重的副作用，如细胞因子释放综合征（CRS）。CRS 也称为细胞因子风暴或细胞因子相关毒性，是由于免疫系统对 COVID-19 等感染或在 CAR 免疫细胞疗法等免疫疗法治疗后反应过度，产生大量炎性细胞因子，尤其是 IL-6而引发的。

表2 不同CAR-T细胞的比较

同样，一些临床结果显示CAR-NK细胞伴有一些副作用，但CAR-NKT细胞没有任何副作用的迹象。然而，CAR-NKT细胞安全性的绝对结果需要进一步研究。一项针对神经母细胞瘤癌儿童的研究表明，在施用第一代或第二代CAR-NKT细胞（NCT032294954）时没有出现CRS或神经毒性。此外，由于CAR-NKT细胞具有不依赖MHC的抗原识别能力、TCR的奇怪性质以及不产生IL-6，因此它可以预防GVHD而不会增加疾病复发的风险。有趣的是，移植的供体NKT细胞在保护动物模型免受GVHD侵害方面至少比T调节细胞强10倍，从而损害了移植物抗白血病效应。

至于治疗费用，临床上 CAR-NKT 细胞的最终费用估计比 CAR-T 细胞疗法低得多。CAR-T 细胞疗法的高成本源于不良反应、副作用管理、个人生产和重复剂量处方，而 CAR-NKT 细胞则没有这些成本。至于功能，CAR-NKT 细胞是第一个迁移到肿瘤部位的细胞。此外，它比其他细胞更能渗透到 TME，因此它可能对肿瘤细胞发挥更早、更有效的作用。CAR-NKT 细胞和 CAR-NK 细胞的共同优势是它们具有双重功能。这意味着它们可以通过受体和 CAR 结构识别肿瘤抗原，而 CAR-T 细胞只能通过 CAR 结构识别它们。由于 CD1d 在不同细胞中广泛表达，因此 CAR-NKT 细胞的优势更为明显。CAR-NKT 细胞的另一个优势是，在小鼠模型中， CAR-NKT 细胞通过诱导 CD8 + T 细胞交叉引发和 CD103 + CD8α 许可，使 DC 细胞能够与 T 细胞一起启动长期抗肿瘤功能。除了给药特性之一外，CAR-T 细胞还会在体内停留一个月到一年，这可能会导致“靶向/脱瘤”毒性。Rotolo 等人进行的比较研究表明，CD1d 限制性的工程化 CD19-CAR-NKT 细胞比 CD19-CAR-T 细胞在体内对抗 CD1d 表达淋巴瘤的效果更好。他们在小鼠模型中没有观察到任何 GVHD 的迹象，有趣的是，仅需一剂量的 CAR-NKT 细胞就足以显著影响肿瘤清除。

与 CAR-NK 细胞相比，CAR-NKT 细胞还具有多项优势。事实上，CAR-NKT 细胞具有多种受体，可以比 NK 细胞更好地调节免疫系统。此外，与参与血液循环的 NK 细胞不同，NKT 细胞存在于血液和组织中，这在实体肿瘤中至关重要。此外，NKT 细胞具有记忆细胞，并且比 NK 细胞更具持久性。

CAR-NKT 细胞的另一个关键优势是它们能够消除实体瘤。实体瘤的复杂结构对不同的治疗方法构成了强大的障碍，但 CAR-NKT 细胞的结果令人鼓舞。遗憾的是，尚未在实体瘤中对 CAR-T 细胞和 CAR-NKT 细胞进行比较，但在其他癌症类型中的比较显示 CAR-NKT 细胞疗法效果更好。与 CAR19-T 细胞相比，CAR19-NKT 细胞表现出更有效的肿瘤抑制作用，具有更高的中枢神经系统渗透率和更高的存活率。在一项关于黑色素瘤的研究中，硫酸软骨素蛋白聚糖 4 (CSPG4) 抗原被作为必需的肿瘤抗原。该研究结果报告称，在相同的扩增率下，CAR 在 CAR-NKT 细胞中的表达速度更快，而 PBMC 中的 T 细胞数量是 NKT 细胞的十倍。与细胞因子分泌相比，CAR-T细胞产生的细胞因子更多，但CAR-T细胞和CAR-NKT细胞的细胞因子分泌率均显著更高；即便如此，CAR-NKT细胞消灭肿瘤细胞的速度也更快。有趣的是，CAR-NKT细胞和CAR-T细胞的CAR细胞毒性几乎相等，而CAR-NKT细胞的副作用并不比CAR-T细胞更明显。尽管CAR-NKT细胞的研究尚未取得重大进展，但迄今为止所做的工作表明，这些细胞在癌症治疗中具有高效性和安全性，潜在风险最小。

CAR-NKT 细胞处于临床前研究中

已经进行了临床前研究以评估 CAR-NKT 细胞在不同类型癌症中的抗肿瘤功效（表3）。Haczey 等人是 CAR-NKT 细胞研究的先驱。他们用逆转录病毒转染细胞，该逆转录病毒靶向二唾液酸神经节苷脂 (GD2)，神经母细胞瘤癌细胞中的主要靶抗原。他们创建了不同类型的 CAR 重定向 GD2-NKT 细胞构建体，这些构建体编码：(1)单独的 CD3ζ 链，(2)带 4-1BB 的 CD3ζ，(3)带 CD28 的 CD3ζ，和(4)同时使用 CD28 和 4-1BB 内结构域的 CD3ζ。CD28 和 4-1BB 内结构域的表达均显示 NKT 细胞在体内的持久性显著增强。所有结构均有效定位于肿瘤部位，对表达 GD2 的神经母细胞瘤和 CD1d +抑制性巨噬细胞表现出很强的细胞毒性，结果良好，且未显示 GVHD 的证据。此外，CAR-NKT 细胞改善了治疗质量，增加了 NKT 细胞在 TME 中的抗性和定位，而对神经母细胞瘤没有任何显著的特殊毒性。另一方面，据报道，经 α-GalCer 脉冲的 CAR-NKT 细胞可分泌穿孔素并在靶向 Jurkat 细胞（表达 CD1d 分子的人类 T 细胞白血病细胞系）时发挥内在细胞毒性。相反，CD8 + T 细胞表现出非特异性的背景裂解。再如，研究发现，CD62L-CD19 CAR-NKT 细胞在 B 细胞淋巴瘤小鼠模型中引起肿瘤完全消退。当CD62L与CD86、4-1BB、OX40L共刺激分子结合时，可以显著提高NKT细胞扩增的临床规模。

表3 CAR-NKT细胞临床前研究

在另一项临床前研究中，γδT 细胞 (Vy9Vdelta2) 和细胞因子诱导的杀伤 (CIK) 细胞同时扩增，这些细胞被称为 CIKZ 细胞。这两种细胞都是 T 细胞和 NKT 细胞的异质性群体，它们分别扩增，并在体外对不同的肿瘤细胞表现出显著的细胞毒性。扩增的 CIKZ 细胞表现出抗肿瘤细胞毒性，并且可以被修饰以表达抗 C19 CAR、抗 HER2 CAR 和抗 CEA CAR。CAR 修饰的 CIKZ 细胞比 CAR 修饰的 αβ T 细胞显示出更好的细胞毒作用。此外，研究人员报告称，在 B 细胞淋巴瘤小鼠模型中，使用 CD19-CIKZ-CAR NKT 细胞与 CD28 内域后，表现出抗肿瘤特性和更长的生存期。

另一项研究通过宿主 CD8 + T 细胞交叉启动关注 CAR-NKT 细胞的活性，并证明 CD19.28z-CAR NKT 细胞对表达 CD19 的荧光素酶转导的 A20 淋巴瘤细胞具有剂量依赖性细胞毒性作用。与未经治疗的小鼠和接受未转导 NKT 细胞的小鼠相比，CAR-NKT 细胞可以显著控制肿瘤细胞的进展和发展，并提高动物存活率。同种异体 CAR-NKT 细胞和自体 CD8 + T 细胞的共同给药具有协同作用，可以显著改善肿瘤控制并增加小鼠模型存活率。此外，同种异体 CAR-NKT 细胞在表型、转录组和克隆库方面塑造了 CD8 + T 细胞区室。这些结果表明，在免疫功能正常的宿主中，同种异体 CAR-NKT 细胞在诱导延长肿瘤控制方面明显优于同种异体常规 CAR-T 细胞。另一项近期临床前研究报告称，靶向 CAR-NKT 细胞的 CD38 和浆细胞特异性 B 细胞成熟抗原 (BMCA) 成功消除了多发性骨髓瘤 (MM) 肿瘤细胞，且没有任何 TCR 依赖性细胞毒活性。该组合系统通过刺激产生许多细胞因子并进行大力扩增。

综上所述，所有关于这些细胞的疗效和安全性的临床前研究都承认CAR-NKT细胞在体内和体外均具有完全的功能，并且其对癌细胞具有相当有效的治疗效果。尽管临床前研究很少，但第一批结果显示这些细胞对肿瘤具有较高的疗效和安全性。

CAR-NKT细胞的临床应用

由于CAR-NKT细胞在临床前研究中取得了良好的结果，一些临床试验也已开展，以评估CAR-NKT细胞治疗癌症的安全性和有效性；其中一些已经发表结果，但其他一些仍在进行中（表4）。例如，Heczey等人进行了一项试验研究，通过CD4 + CD62L +细胞（NCT03294954）评估自体CAR-GD2表达IL-15 NKT细胞（GINAKIT2）对三名儿童患者难治性/复发性神经母细胞瘤癌的作用。结果表明CAR-NKT细胞可以在体内大量扩增，定位于肿瘤微环境并有效消灭癌细胞。他们证明GINAKIT2在体内比GD2-CAR NKT细胞具有更好的肿瘤浸润、持久性和抗肿瘤活性。NKT 细胞的刺激是由 α-GalCer 完成的，最终纯度令人难以置信（94.7%）。它们对患者完全施用了剂量耐受性，没有观察到任何剂量限制性毒性，如 CRS 或神经毒性。此外，这种结构可以在体内检测到，施用后，在复发或难治性疾病中诱导骨转移和肿瘤消退。

表4 临床试验中的CAR-NKT细胞

正在进行的第二个研究领域集中于 hCD19.IL15.CAR-NKT 细胞的可行性和安全性，旨在根除复发/难治性高风险 B 细胞肿瘤。本研究使用的结构是通用 NKT 细胞表达 hCD19 CAR 和 IL-15 (NCT04814004)。最近，一项试验研究评估了复发或难治性 B 细胞恶性肿瘤中表达 CD19 特异性 CAR 和 IL-15 的同种异体 NKT 细胞 (NCT05487651)。这项多中心研究评估了 KUR-502 对难治/复发性 B 细胞 NHL 或白血病患者的安全性。然而，推动使用 CAR-iNKT 细胞癌症治疗的努力仍在进行中，需要更多的临床试验来证明这种治疗在不同血液学和实体肿瘤中的有效性。

CAR-NKT 细胞治疗面临的挑战

与CAR-NK和CAR-T细胞一样，CAR-NKT细胞免疫疗法也面临一些挑战，限制了其在临床环境中的功能和广泛使用（图3）。令人鼓舞的是，其中一些挑战可以通过近期开发的策略得到纠正，例如基因组编辑、设计智能可编程CAR细胞和联合治疗方法。所有增强的NKT细胞都是使正常功能细胞更有效所必需的。这种方法是强制性的，这些细胞的功能障碍，特别是在IFN-γ产生方面的功能障碍，会降低TME中基于NKT细胞的免疫疗法的质量。NKT细胞治疗进展的另一个障碍是这些细胞的数量在其来源地很少。因此，NKT细胞分离和选择性扩增方面的进展可以为基于NKT细胞的免疫疗法打开新的窗口。由于癌症患者的免疫细胞数量少、功能障碍以及免疫细胞向TME的浸润低，这两个近期问题已成为癌症患者的重大危机。其他障碍包括肿瘤细胞中 CD1d 表达降低、输注后 α-GalCer 无能，以及 NKT 细胞和自体 DC 细胞在培养基中过继转移需要很长时间才能完成，这导致一些患者放弃治疗或不再适合接受治疗。

图3 优化CAR-iNKT细胞治疗的新方法，总体概述。

与正常微环境相比，TME 在细胞和因素方面存在差异，例如影响CAR免疫细胞抗肿瘤功能的APC类型、抗原变体、细胞因子和代谢物。此外，由于肿瘤细胞的糖酵解活性，TME 的葡萄糖来源有限和乳酸积累，这直接干扰了CAR-NKT细胞的功能。此外，葡萄糖缺乏会通过干扰 TCR 信号转导来减少 IFN-γ 的产生，因为糖酵解会放大 TCR 囊泡循环并维持 NKT 细胞中的 TCR 信号转导。此外，IL-4 的产生对 TCR 信号的依赖性最小。然后，IL-4 的产生增加并使细胞向 Th2 细胞极化，而 Th2 细胞被认为是肿瘤细胞的最爱。

此外，TME 中乳酸的积累会干扰脂质合成，从而抑制 NKT 细胞产生 IFN-γ。乳酸通过抑制 mTORC1 的激活来降低 NKT 细胞中 PPARγ 的表达。NKT 细胞中的主要转录因子 PPARγ 与 PLFZ 协同作用，促进控制脂质合成的 SREBP1 转录。胆固醇可改善 TCR 信号传导，从而增加 IFN-γ 的产生。据报道，TME 中乳酸积累导致 PPARγ 表达降低，从而抑制了小鼠肝细胞癌模型中胆固醇的合成，并降低了 NKT 细胞产生 IFN-γ。NKT 细胞和 DC 之间的串扰过程受到干扰，导致 TME 中的抗肿瘤免疫反应功能障碍。这些细胞之间的串扰改善了 Th1 细胞免疫反应，这种反应由细胞分裂控制蛋白 42 同源物 (Cdc42) 控制。Cdc42 显著控制细胞迁移和相互作用，从而降低 NKT 细胞中 Cdc42 的表达，破坏肿瘤内 NKT 细胞的相互作用和活化。CAR-NKT 细胞疗法发展面临的最后一个挑战是 TME 中的持续时间。随着肿瘤的进展，细胞功能显著下降，并变得功能失调。尽管在改进实体瘤的 CAR NKT 细胞疗法方面做出了广泛的努力并取得了突破，但这种治疗方法与其他治疗方法一样遇到了一些障碍。存在的问题在其他免疫治疗方法中很常见；有些是可以解决的。值得注意的是，与 CAR T 细胞或 CAR NK 细胞疗法相比，CAR NKT 细胞疗法的挑战非常低。

安全性和有效性改进策略

NKT 细胞先天特征强化策略

CAR-NKT细胞的调节功能

NKT 细胞具有独特的调节特性，这些特性可能比细胞毒性更重要。NKT 细胞可通过 CD1d/TCR 和 CD40/CD40L 相互作用影响树突状细胞 (DC)。它们还可以增加树突状细胞上共刺激分子的表达，如 CD40、CD80 和 CD86，从而诱导 IL-12 和 CXCL16 的产生。一方面，CXCL16 可提高 NKT 细胞产生 IFN-γ。另一方面，IL-12 可增强 NKT-、NK-、Th1- 和 CD8 + T 细胞产生 IFN-γ。此作用构成了支持效应细胞抗肿瘤活性的正循环。NKT 细胞将 M2 巨噬细胞 (肿瘤相关巨噬细胞或 TAM) 的极化重新编程为炎性 M1 巨噬细胞，并降低免疫抑制依赖性 TME。MDSC 在 TME 中的积累会诱导免疫细胞丧失活力，干扰免疫反应，增加肿瘤细胞生长，重塑 TME，并提高转移率。有趣的是，NKT 细胞通过几种机制抑制 MDSC；例如，它们在流感模型中阻断精氨酸酶 1 和 NOS2、在 4T1 乳腺癌模型中降低 MDSC 的频率并抑制其活性，并将 α-GalCer 负载的 MDCS 转导为成熟的 APC，从而能够在 T 细胞和 NK 细胞中诱导免疫反应。此外，活化的 NKT 细胞通过交叉调节程序减少 II 型 NKT 细胞的数量和功能，消除这些细胞对免疫系统的有害影响，尤其是在癌症治疗中。

NKT 细胞除了具有自我调节功能外，还受其他免疫细胞的调节。例如，T reg细胞抑制由树突状细胞成熟受损介导的 NKT 细胞间连接功能。T reg细胞对 CD4 + NKT 细胞的影响大于对 CD4 − NKT 细胞的影响，并诱导 CD4 + NKT 细胞丧失活力，最终降低基于 NKT 细胞的免疫疗法的临床疗效。因此，在晚期癌症治疗中，T reg细胞耗竭和 NKT 细胞从丧失活力状态的恢复可增强 NKT 细胞的细胞毒性功能。NKT 细胞可通过多种机制直接促进 CD8 + T 细胞活化，如由局部可溶性因子（主要是 IFN-γ）介导的 CD1d 干扰、T 细胞的直接相互作用和独立的树突状细胞。此外，NKT 细胞还可以通过不同的机制（如细胞因子分泌和与其他细胞（如 NK 细胞）直接相互作用）调节先天免疫系统的其他部分。因此，CAR-NKT 细胞除了具有细胞毒性能力外，还在几乎所有免疫系统中发挥调节功能。由于癌症会导致免疫系统严重功能障碍，因此这种作用在癌症治疗中起着重要作用。

替代糖脂输送

由于 α-GalCer 输注面临不同的障碍，从人工 APC、纳米颗粒、外泌体和脂质体等载体获得帮助可能会有所帮助。一些研究表明，与游离 α-GalCer 相比，α-GalCer 结合载体在癌症治疗中具有有益作用，例如增加 NKT 细胞扩增和细胞因子产生以及降低肿瘤负担。由于DC 对抗原的吸收和呈递增强，这种治疗效果可以增强，从而增加 NK 和 T 细胞的下游反应。有趣的是，由于呈递的 α-GalCer B 细胞数量减少，α-GalCer 结合载体不会在 NKT 细胞中诱导无能表型。采用脂质复合物载体、二氧化硅微粒和聚乳酸-乙醇酸 (PLGA) 纳米颗粒等其他载体也表明 NKT 细胞功能增强。利用载体的关键在于这些机制与 α-GalCer 相比是否保留了其治疗优势，有助于改善免疫系统。新开发的方法导致了药物或糖脂递送系统的改进，因为它们的目的是将 NKT 细胞活化因子包装在基于纳米颗粒的结构中。先进免疫疗法的一个重要例子是利用“相关药物”，例如包装成微球或脂质体的 α-GalCer，与 CAR-NKT 细胞单一疗法相比，它们在癌症治疗中表现出更好的功能反应。

改性糖脂类似物

尽管 α-GalCer 并非完美无缺，但几乎所有 NKT 细胞免疫疗法临床试验都使用 α-GalCer 作为 NKT 细胞刺激因子，这凸显了 α-GalCer 的重要性。令人鼓舞的是，越来越多的改性糖脂可能改善治疗效果。α-GalCer 的化学修饰可产生该配体的几种类似物，对 NKT 细胞中的 Th1 细胞因子反应有显著影响。例如，用 C-糖苷取代 O-糖苷键可产生 α-c-GalCer 结构，该结构具有很强的增加 NKT 细胞产生 IFN-γ 和 IL-12 的能力。此外，使用 α-c-GalCer 不会增加 IL-4 的产生，这表明它偏向 Th1 表型。尽管 α-c-GalCer 在黑色素瘤模型中具有比 α-GalCer 更好的治疗效果，但该物质无法成功刺激人类 NKT 细胞。该物质在临床前领域的成果令人鼓舞，为寻找在人类 NKT 细胞中起决定性作用的新型治疗剂带来了希望。另一种物质是 7DW8-5，与 α-GalCer 相比，它对 CD1d 和 TCR 的结合亲和力更强，在增加 NKT 细胞的 IFN-γ 和 IL-2 产生方面更有效。7DW8-5对 NKT 细胞的刺激在几种小鼠疫苗接种病例中表现出 Th1 和 CD8 + T 细胞应答增强，但它尚未用于癌症病例。与 α- c -GalCer 不同，7DW8-5 在体外对人类 NKT 细胞产生了更大的刺激。此外，7DW8-5 在流感疫苗中刺激了恒河猴的 NKT 细胞；由于恒河猴 NKT 细胞与人类的相似性，7DW8-5 也许在未来作为治疗药物在人体临床试验中进行研究的潜力巨大。

最近，一种名为 RK 的新型抗原糖脂已被开发用于改善癌症治疗。根据已发表的研究结果，通过增强 NKT 细胞功能，负载 RK 的树突状细胞 (DC) 可在人类和小鼠癌症模型中改善 IFN-γ 和 T 细胞长期记忆的产生。例如，研究发现，在转移性黑色素瘤的小鼠模型中，负载 RK 的树突状细胞可预防转移。尽管负载 RK 的树突状细胞治疗比 α-GalCer 更有效且没有副作用，但它们在临床试验中的使用仍需要更多证据。糖脂可能有助于有效的 CAR-NKT 细胞免疫疗法，但选择最佳糖脂仍需要更多研究。

CAR-NKT细胞性能改进策略

CD1d 的转录调节

增强CAR-NKT细胞疗法效果的有效方法之一是通过转录或表观遗传调节CD1d来修饰靶细胞。例如，通过诱导淋巴瘤细胞和CLL-B细胞上更多的CD1d翻译和表达，可以改善CAR-NKT细胞的抗淋巴瘤功能，这是由全反式维甲酸（ATRA）介导的。该平台可以在CAR结构的基础上增强NKT细胞免疫疗法的功能。

倒置细胞因子受体 (ICR)/SynNotch CAR

倒置细胞因子受体 (ICR) 和 SynNotch CAR 是通过组织特异性配体与细胞表面之间的连接激活的合成跨膜受体。SynNotch 受体的激活启动了细胞中的转录途径。之后，这些受体可以提高 CAR-NKT 细胞对肿瘤识别的灵敏度并增强其功能。这种方法已在 CAR-T 细胞中进行了评估并取得了成功的结果，但尚未在 CAR-NKT 细胞中使用。此外，该方法可以与 TRUCK 细胞等其他增强方法相结合，以增强 CAR-NKT 细胞疗法的疗效。

CRISPR-Cas9 基因组编辑

基因组编辑（如 CRISPR-Cas9）、基因敲除和基因敲减[如短发夹RNA（shRNA）]技术是其他有助于提高CAR免疫细胞抗肿瘤功能的方法。CRISPR-Cas9是一种具有高靶向特异性的基因编辑方法，可提供肿瘤诱导的耗竭细胞抗性。该技术已用于删除CAR-T细胞中TCRα链、TCRβ链、β2M和PD-1的表达。这些技术可以通过在干细胞分化的免疫细胞中实现稳定且显著的基因消融来影响干细胞。在CAR-NKT细胞中增强CRISPR/Cas9系统的能力非常有限，但研究证明了其实用性。例如，首次试验表明，在CAR-NKT细胞中使用CRISPR/Cas9系统可增加持久性和CD62-L表达。在另一项研究中，在GD2-CAR NKT细胞中通过CRISPR/Cas9系统过表达淋巴增强子结合因子1（LEF1），在神经母细胞瘤异种移植小鼠模型中表现出优异的控制效果。

自杀基因技术

另一种方法是自杀基因改造，它与CAR治疗相结合，可预防插入性致癌风险。大多数被接受用于自杀基因的病毒来自单纯疱疹胸苷激酶（HSV-TK），它对抗病毒核苷类似物更昔洛韦（GCV）有敏感性，并为通过正电子发射断层扫描（PET）进行可视化以改进细胞追踪提供了可能性。此外，已经开发出一种替代的自杀开关系统，用于CAR-NKT细胞疗法并提高治疗质量。这些系统的例子有表达Fas信号部分的融合蛋白和在小分子配体的转录后调控下的胱天蛋白酶（icasp）。

TRUCK NKT 细胞

T 细胞重定向至通用细胞因子杀伤 (TRUCK) 是一种带有转基因有效载荷的工程 T 细胞，可通过激活 CAR 产生细胞蛋白质和其他细胞区室。TRUCK 经过特别改造，可提高 CAR-T 细胞对实体肿瘤的治疗功能。TRUCK 产生的最挥发性成分是 IL-12，它可以重新编程 TME 并增强 CAR-T 细胞的抗肿瘤功能。该方法已应用于 CAR-NK 细胞，并在淋巴瘤小鼠模型中取得了良好的效果。因此，CAR-NKT 细胞是转导转基因编码 NKT 细胞刺激细胞因子（如 IL-21 和 IL-2）的合适候选细胞。

蛋白质组检测器 CAR-NKT 细胞 (TCR-CAR)

NKT 细胞具有独立于 MHC-I 的抗原识别系统，而 T 细胞的主要焦点则基于 T 细胞受体 (TCR)。基于 TCR 对 NKT 细胞进行工程改造可提高 MHC-I 识别能力，从而提高这些细胞的治疗特异性。此选项适用于 NK 细胞。这样，NK-92 细胞就被 TCR-CAR 武装起来，TCR-CAR 可以识别 MHC-I 分子并显著影响肿瘤细胞。相反，NKT 细胞具有在靶细胞上表达的 CD1d 配体的受体。事实上，装甲细胞被创造出来是为了靶向几种肿瘤抗原，这可能表明高质量的癌症治疗。尽管这种方法的有效性仍有待证实，但仍需要进行各种研究以获得更多信息，确定它是否会摧毁大量肿瘤细胞。

跨信号传导 CAR-NKT 细胞（可诱导 CAR）

可诱导型CAR最近被添加到CAR类型中。可诱导型CAR在将药物施用于体内后具有激活能力。该方法已在CAR-T细胞免疫疗法中进行了尝试，随后在小鼠模型中增加了IFN-γ的产生、细胞毒性功能和存活率。此外，增殖和细胞因子产生受该系统有效调节。有趣的是，这种方法可以预防一些副作用并提高常规免疫疗法的治疗质量。例如，可诱导的MYD88/CD40（iMC）是一种跨细胞开关蛋白，在暴露于rimiducid后被激活，可用于可诱导型CAR系统。iMC激活也可以诱导T细胞的增殖和活化。一项研究评估了异位IL-15.iMC对抗CD123/BMCA CAR-NK细胞的细胞毒性和细胞因子分泌的影响。因此，这种结构增强了CAR-NK细胞的抗肿瘤功能和持久性。因此，在CAR-NKT细胞结构中采用这种实用策略将提高其抗肿瘤活性。

CAR-NKT细胞结构中NKT细胞功能的进展

DC 负载 α-GalCer；一种新的 α-GalCer 给药方法

用 α-GalCer 激活 NKT 细胞可能合适，但存在不同的问题。建议自体 NKT 细胞在 α-GalCer 物质的作用下在体外增殖，然后再回输以改变 TME 中 NKT 细胞功能的受损情况。为了减少 α-GalCer 给药的有害影响，如诱导无能和低免疫原性，建议使用负载 α-GalCer 的 DCs。由于 CD-40 和 IL-21 的共同信号传导，DC 可激活更多的 NKT 细胞并具有低诱导无能性。该方法在肿瘤模型中降低了肿瘤细胞生长和转移进展。它还增加了 NKT 细胞的扩增和活化以及 IFN-γ 的产生，而没有任何特殊的副作用，主要是在使用成熟的 DC 细胞时。此外，该策略在临床试验中表现出较长的生存期，并显示出对非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的治疗效果改善。当 NKT 细胞缺陷时（如在不同癌症中一样），该过程不会产生不良影响。

双特异性融合蛋白

使用 α-GalCer/CD1d 抗肿瘤融合蛋白可以提高 NKT 细胞的特异性。帮助 NKT 细胞牢固影响肿瘤细胞的重要因素之一是肿瘤细胞上存在 CD1d 受体。因此，为了增强 NKT 细胞功能，可以使用 CD1d-抗体融合蛋白将 NKT 细胞引导至肿瘤细胞。通过这种方式，CD1d 配体的 N 端侧与 B2 微球蛋白连接并产生可溶性 CD1d (sCD1d)。然后，ScFv 片段与针对肿瘤标志物的 sCD1d 连接。该结构在给药前装载有 α-GalCer。最近，针对人表皮生长因子受体 2 (HER2)、癌胚抗原 (CEA) 和 CD19 等肿瘤抗原制造了 CD1d-抗体融合蛋白。在这种情况下，Horn 等人证明 CD3xpd-L1 双特异性 T 细胞接合剂 (BiTE) 可以激活 T 细胞和 NKT 细胞，从而在体外破坏 PD-L1 +肿瘤细胞。因此，提高 NKT 细胞的特异性可能不是提高 NKT 细胞免疫疗法效果的最有希望的方法。这种方法也在黑色素瘤模型中进行了研究，结果显示 DC、NK 和 CD8 T 细胞的功能得到改善。当 NKT 细胞比平时更活跃时，它们可能会诱导先天和适应性细胞的耐受性，并以抗肿瘤的方式增强免疫抑制状态。

光热治疗

新的研究表明，光热疗法可改善 NKT 细胞的抗肿瘤功能。该策略使用多种方式为 NKT 细胞和 CAR-NKT 细胞更好地发挥作用创造条件。这些方式的例子包括增加肿瘤部位的血流量和分泌更多的细胞因子和趋化因子，从而将免疫细胞募集到肿瘤部位，产生炎症状态，增加肿瘤浸润 NKT 细胞，并导致更多的 IL-1 和 IL-12 细胞因子分泌。这些细胞因子的产生可激活 NKT 细胞并改善树突状细胞的募集和成熟，从而对 NKT 细胞产生积极影响。在这种情况下，上述机制显著促进了 NKT 细胞产生 IFN-γ、CD107a 和颗粒酶 B。这些过程以 CD1d 依赖的方式改善了 NKT 细胞功能，而没有任何明显的副作用。

多能干细胞衍生的iNKT细胞

开发基于 NKT 细胞的免疫疗法的主要障碍之一是从癌症患者的 PBMC 中分离出足够的 NKT 细胞。因此，合适的来源可以帮助推进这种治疗。一种有价值的策略是使用来自患者的诱导性多能干细胞 (iPSC)。干细胞是产生所有免疫细胞的良好且可接受的来源，并且可以接受基因序列来表达它们，例如 CAR。这些细胞具有自我更新的潜力，这可能会减少多次注射的需要。此外，它们可以用于现成的工艺，从而可以降低免疫疗法的成本。此外，通过新工具对这些细胞进行基因改造、细胞武装和实现新的抗肿瘤机制使它们成为对抗肿瘤的强大细胞。iPSCs-iNKT 细胞由 C57BL/NKT 脾细胞产生，通过核移植进入胚胎干细胞，并通过表达 Oct3/4、Sox2、KIf4 和 Nanog 等重编程因子进行修饰，以诱导逆转录病毒的多能性。转移到小鼠体内后，iPSCs-iNKT 细胞可以产生大量的 IFN-γ，同时保持抗肿瘤特性。此外，一些研究使用了 iPSCs-iNKT 细胞，并证明了其在配体脉冲 DC 激活后具有较高的细胞因子产生、抗肿瘤细胞毒性和自体 NK 细胞能力。因此，通过创建 iPSC-CAR NKT 细胞，抗肿瘤功能将得到进一步巩固。

抑制性 II 型 NKT 细胞

II 型 NKT 细胞在逃避免疫系统的肿瘤中具有促进作用，从而增加了肿瘤存活率。因此，抑制这些细胞可以成为癌症免疫治疗的一个有益策略。预防 II 型 NKT 细胞的方法之一是应用改变或阻断这些细胞反应的脂质。NKT 细胞有几种具有不同细胞信号传导功能的硫苷脂抗原。最近，一种独特的 II 型 NKT 细胞硫苷脂抗原异构体 C24:2 被引入，并显示出对肺癌转移进展的显著抑制作用。相反，其他类型的硫苷脂异构体，如 C24:1 和 C24:0，增加了肺癌小鼠模型中肿瘤转移的发展。CpG ODN 是 TLR9 的激动剂，已被用作癌症疫苗佐剂。CpG ODN 激活的 NKT 细胞在 B16 黑色素瘤模型中表现出功能性。事实上，由于 DC 细胞对这种物质敏感，它们诱导 NKT 细胞产生 IFN-γ，而不会增加 IL-4 水平。然而，一些研究发现 CpG ODN 限制了 NKT 细胞，并在 NKT 细胞中表现出调节功能和负反馈机制，控制 NKT 细胞过度激活反应。

CAR-NKT 细胞联合疗法

与化疗联合

一些化疗药物表现出免疫刺激功能，增强免疫细胞向TME的浸润，并增强正在进行的免疫治疗的效果。利用顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤和依托泊苷等化疗药物可增强肿瘤细胞对NKT细胞的敏感性，并在体外影响TRAIL和Fas配体（FasL）的功能。此外，用吉西他滨或环磷酰胺预处理诱导的免疫原性细胞死亡（ICD），提高了NKT细胞免疫治疗的疗效，并延长了4T1乳腺癌模型的体内生存期。然而，在基于NK和CD8 T细胞的免疫疗法中并未观察到这种增加。那些没有诱导ICD潜力的药物，如顺铂和5-氟尿嘧啶 (5-FU)，可增强NKT细胞功能、死亡细胞的肿瘤抗原释放以及树突状细胞的抗原呈递，这在间皮瘤和结肠癌模型中都有所证实。在这些化疗药物中，来那度胺是一种倍增细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，其临床效果最佳，可减少肿瘤细胞增殖和癌症进展。这种药物的作用包括降低血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达、限制肿瘤血管生成、增强T细胞增殖、改善NK细胞功能、增强NKT细胞扩增以及上调体内和体外IFN-γ的产生。接受来那度胺治疗的骨髓增生异常患者的临床结果表明，体内和体外均出现了上述结果。在一项使用来那度胺联合 NKT 细胞治疗无症状骨髓瘤的 I 期临床试验研究中，患者完全耐受该治疗，但有一例患者伴有 3 级不良事件。治疗增加了 NKT 细胞、NK 细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞，从而改善了肿瘤环境下的先天免疫反应。此外，除一名患者外，该治疗降低了所有患者的肿瘤相关免疫球蛋白，表明肿瘤负荷减轻。因此，正如先前的研究表明，将化疗与 CAR-NKT 细胞疗法相结合是提高治疗效果的理想方法。

与放射治疗联合

放射疗法 (RT) 结合细胞免疫疗法可对癌症产生有益作用。例如，RT 与 CAR-T 细胞疗法相结合，在 B-NHL、肺癌和前列腺癌等不同癌症中显示出令人鼓舞的结果。最近，这种策略可能有益于治疗 CAR-T 细胞耐药性实体瘤。对于 CAR-NKT 细胞疗法，RT 似乎在 NKT 细胞中具有高增殖反应，并提高了其体外抗肿瘤活性。此外，NKT 细胞与 RT 一起表现出比 CD8 + T 细胞更好的效果。不一致的是，一项研究的结果表明，NKT 细胞的数量和对 IL-2 和 α-GalCer 的反应扩增能力在 RT 之前和之后没有差异。这个问题从未在CAR-NKT细胞上进行过评估，其效果还需要对这些细胞进行更多的实验。RT作为一种有效的癌症治疗方法，将是与CAR-NKT细胞结合的良好治疗候选者。

与溶瘤病毒联合使用

溶瘤病毒能精准感染和裂解肿瘤细胞。大量证据表明，这些病毒可直接破坏肿瘤细胞，并通过增加免疫细胞活化和 APC 呈递更多抗原来刺激免疫系统反应。有趣的是，据报道，将 NKT 细胞疗法与具有 ICD 高潜力的溶瘤病毒相结合可提高免疫疗法的质量。建议与 CAR-NKT 细胞结合以改善其功能的溶瘤病毒包括水泡性口炎病毒 (VSV) 和呼肠孤病毒，它们均显示出成功的结果。因此，与 NKT 细胞单一疗法相比，将 VSV 与 NKT 细胞疗法相结合可提高乳腺癌和卵巢癌小鼠模型的生存率并降低转移负担。此外，研究表明，表达15-羟基前列腺素脱氢酶前列腺素E2失活酶的疫苗病毒可以使耐药肿瘤对iNKT细胞治疗敏感。因此，这种联合疗法是使用CAR-NKT细胞的另一种方法，在研究中具有重要的意义。

与检查点抑制剂联合使用

一种有用的免疫治疗方法是利用免疫检查点抑制剂。将 NKT 细胞疗法与免疫检查点抑制剂相结合可抑制抑制性免疫信号和受体。PD-1 和细胞毒性 T 淋巴细胞抗原 4 (CTLA-4) 受体通过阻断 CD3/CD28 信号传导来抑制免疫细胞的抗肿瘤功能，该信号传导由葡萄糖代谢的上调和与细胞内通路的相互作用介导。CTLA -4 抑制剂在调节免疫反应中起重要作用，可能与 NKT 细胞治疗联合使用有帮助。α-GalCer 的刺激和阻断 PD-1 或 PD-L1 的检查点抑制剂可以抑制 PD-1/ PD -L1 轴，可能有助于克服这一限制。研究表明，在 PD-1 耐药性肿瘤中，NKT 细胞的激活避免了 CD8 + T 细胞无能。针对这一事实，已经进行了一项临床试验研究，以评估 NKT 细胞疗法与 PD1/PDL1 抑制剂的联合使用。在该试验中，使用了 ABX196（一种合成改良的 α-GalCer 激活 NKT 细胞），它在 Hepa 106 异种移植肝细胞癌 (HCC) 模型 (NCT03897543) 中导致抗肿瘤细胞毒性升高。使用 ABX196 可增加 NKT 细胞的 IFN-γ 产生和 Th1 偏斜，而不会影响 TME 中的 IL-4 产生。在黑色素瘤、结肠癌和乳腺癌癌症模型中，ABX196 单独使用或与抗 PD-1 联合使用时，可促进肿瘤消退并提高生存率。该试验评估了 10 名患者，其中 5 名看到了临床益处。一名患者出现部分缓解，四名患者病情稳定，没有任何危及生命的副作用。因此，ABX196 与 PD-1 阻断抗体 (Nivolumab) 联合使用对接受过免疫检查点抑制剂 (ICI) 治疗的 HCC 患者有显著效果。招募检查点抑制剂作为一种新的免疫治疗方法可以有效影响 CAR-NKT 细胞疗法并改善患者的临床结果。

与免疫刺激剂联合使用

与 CAR-NKT 细胞疗法相结合的另一种适当的免疫治疗策略是使用免疫刺激剂，例如单克隆抗体 (mAb) 和细胞因子。mAb 靶向免疫刺激受体，如 4-1BB、CR5 和 CD40，然后激活影响多种癌症的抗肿瘤免疫。不同的 mAb，例如抗 CD52、抗 VEGF、抗 CD33、抗 HER2 和抗 EGFR，已用于癌症治疗并显示出显著的改善结果。尽管具有临床益处，但其中一些显示出有限的反应、不同的副作用和癌症复发。然而，研究表明，α-GalCer 与激动剂抗 DR5 和抗 4-1BB 抗体或激动剂抗 CD40 和抗 4-1BB 抗体结合可显著导致肿瘤消退，大约 80% 的小鼠完全消退。在黑色素瘤和乳腺癌小鼠模型中，用 α-GalCer 和免疫刺激细胞因子（如 IL-12 和 IL- 21）治疗可导致肿瘤消退并提高生存率。不幸的是，由于对免疫刺激抗体的安全性和人体临床试验效果的担忧，很少有研究以这种方式进行，因此对于特定的决定，还需要更多的调查。

改善癌症治疗的其他解决方案之一是增强 TME 中的 NKT 细胞功能并更好地识别 Th1 类脂质抗原。例如，CAR-NKT 细胞中 IL-15 的共表达增加了它们在肿瘤部位的定位并改善了肿瘤控制而没有任何毒性作用。此外，IL-15 细胞因子因其改善抗肿瘤功能的能力而受到研究。IL-15 在 T 细胞和 NKT 细胞的功能中起着关键作用，并改善了 CAR-NKT 细胞的肿瘤细胞杀伤活性。如前所述，CAR-NKT 细胞疗法中的关键挑战之一是这些细胞在 TME 或 PBMC 中的存活率和质量。不同免疫刺激剂的组合可以改善紧急环境中的细胞状况。有研究表明，IL-15 偶联的 CD28-CAR 结构可降低耗竭标志物、提高持久性并增强 CAR-NKT 细胞的抗肿瘤功能。与神经母细胞瘤小鼠中的 GD2-CAR NKT 细胞相比，GD2-CAR IL-15 NKT 细胞可改善体外细胞持久性、增加肿瘤部位的细胞定位并增强肿瘤控制。值得注意的是，IL-15 偶联的 GD2 CAR NKT 细胞降低了 PD-1 受体的表达。IL-15 的这些特性使其成为设计基于利用强效抗癌细胞因子的不同类型 CAR-NKT 细胞的绝佳候选者。据报道，PPARγ 及其激动剂的激活可改善抗肿瘤反应和更好的肿瘤控制，同时肿瘤浸润的 NKT 细胞可产生 IFN-γ。因此，在 CAR-NKT 细胞疗法中加入强效细胞因子或 mAb 等免疫刺激因子可增强治疗效果并有助于产生有希望的结果。

结论和未来展望

由于肿瘤的复杂性、智能性以及各种逃避免疫系统的途径，研究应侧重于开发和招募基于智能的治疗方法，如基于免疫的疗法。具有功能能力的 CAR-NKT 细胞具有出色的细胞毒性和调节特性，被认为是一种有效的新型细胞抗癌疗法。这种治疗方法是全新的，要达到最终的治疗效果还有很长的路要走。CAR-NKT 细胞兼具 T 细胞和 NK 细胞的大多数特性，使其成为强大且合适的细胞抗癌治疗选择。此外，CAR-NKT 细胞具有不同的抗癌能力，例如快速识别肿瘤细胞、更高的 TME 浸润率、有希望的细胞毒性以及对免疫细胞的调节功能。通过关注 CAR T 细胞和 CAR NK 细胞疗法的过去经验，设计智能有效的 CAR-NKT 细胞结构并将其与其他治疗策略相结合，可能会为癌症治疗打开新的窗口。临床前研究表明，CAR-NKT 细胞疗法在各种癌症中取得了显著且有希望的成果，科学家们希望他们能够成功治疗癌症。然而，不幸的是，已开发或正在进行的临床试验研究数量有限，而且无法获得更明确的结果，这使得有关这一强效治疗策略的决定充满疑问和争议。利用新的贡献解决方案，例如工程装甲和可编程 CAR、基因转移策略的进展以及以各种方式改善免疫系统状况，可以帮助实现强效的 CAR-NKT 细胞疗法。免疫系统和遗传学之间的相互作用可以创造出新的智能治疗方法，我们有一天可以用它来治疗癌症。CAR-NKT 细胞疗法在癌症治疗中需要更多的研究和光明的未来，我们已经有很多经验可以继续借鉴。