2024年7月3日 发表于 

Molecular Medicine Reports

摘要

DNA甲基化是最早发现的、最重要的表观遗传机制之一。DNA甲基化一般指在DNA甲基转移酶的催化下，以S腺苷蛋氨酸为甲基供体，通过共价键和化学修饰将甲基添加到DNA序列中的特定碱基上。DNA甲基化是诱发癌症的重要因素，DNA甲基化有不同的类型，不同部位的甲基化起着不同的作用。众所周知，结直肠癌(CRC)的进展受到关键基因甲基化的影响。本综述不仅讨论了DNA甲基化与CRC的潜在关系，还讨论了DNA甲基化如何通过影响关键基因来影响CRC的发展。此外，还强调了DNA甲基化在CRC中的临床意义，包括甲基化的治疗靶点和生物标志物的意义；并讨论了DNA甲基化抑制剂作为CRC治疗新策略的重要性。本评论不仅关注最新的研究成果，而且还引用早期的评论作为旧文献的参考。

介绍

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于胃癌和食管癌，在我国肿瘤死亡原因中位居男性第五位、女性第六位。近20年来，结直肠癌发病率呈上升趋势，发病年龄呈上升趋势，在西方发达国家，结直肠癌是仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤，不同国家发病率相差可达60倍。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，约占癌变部位的60%。结直肠癌的发病与饮食习惯、遗传、结肠炎等多种因素有关，多数为散发性，通常是基因和环境共同作用的结果，仅有20%～25%的患者有家族史。仅5%–6%的CRC病例与遗传因素有关，被称为CRC遗传综合征。近年来，西方发达国家结肠癌的发病率呈下降趋势，尤其在50–74岁年龄组，这与癌前病变的防治密切相关。我国结肠癌发病率高的原因之一是缺乏有效的早期检测方法。临床诊断时，大多数结节已为晚期结肠癌。CRC是一种严重的健康风险，全球每年有≥1,000,000例新诊断病例。该疾病的发生是多步骤过程导致结肠黏膜细胞遗传和表观遗传变化积累的结果，主要影响癌基因、抑癌基因和DNA修复基因，所有这些基因都参与CRC发生和发展的关键途径。其中，代表性的抑癌基因p53仍在研究中，不少科学家仍在探讨以p53为靶点的治疗策略。表观遗传过程—DNA甲基化、组蛋白尾部修饰和染色质重塑，以及非编码RNA分子介导的机制—用于描述那些能够在不必改变选定基因DNA序列的情况下修改其表达水平的机制。表观遗传修饰通常由环境诱导，是组织特异性现象。它们可以对致病突变或功能多态性产生类似的影响，因为它们可以沉默、增加或减少选定基因在不同组织中的表达。这与癌症相关基因尤其相关，如肿瘤抑制基因或DNA修复基因。

随着表观遗传学的进展，DNA甲基化与肿瘤的关联成为研究热点。一系列研究揭示了肿瘤发生过程中存在一些特异性的异常甲基化，可作为肿瘤诊断的分子指标。全基因组甲基化分析现已在同步性CRC患者中发现了新的基因，具有改善CRC患者诊断和管理的临床潜力。

本综述主要从DNA甲基化如何影响关键基因，进而影响CRC的发生发展等方面，介绍其临床应用，包括CRC的甲基化生物标志物检测、CRC细胞甲基化预后分析、DNA甲基化与CRC靶向治疗的关系等。最后，强调DNA甲基化是CRC的重要治疗靶点之一，其抑制剂为CRC的临床治疗提供了新的思路。总之，与其他综述相比，本综述从机制、关键基因靶点到临床研究，更全面地介绍了DNA甲基化与CRC的关系，为以DNA甲基化为突破口的CRC治疗提供了支持（图1）。

图1.CRC DNA甲基化研究进展，从六个方面进行综述。本文讨论了其机制、临床应用和未来前景。CRC，结直肠癌；CIN，染色体不稳定性；MSI，微卫星不稳定性。

DNA甲基化

介绍

DNA甲基化是哺乳动物基因调控的多种方式之一，近年来成为表观遗传学的研究热点。DNA甲基化是一种在不改变DNA序列的情况下调控基因表达的DNA化学修饰。广义的DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，通过共价键将甲基添加到DNA序列特定碱基上的化学修饰过程。虽然甲基化修饰方式多种多样，但修饰位点的碱基通常是腺嘌呤n-6、胞嘧啶n-4、鸟嘌呤N-7和胞嘧啶C-5。一般研究中涉及的DNA甲基化主要是指胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）二核苷酸中胞嘧啶第五个碳原子的甲基化过程，该过程的最终产物是5-甲基胞嘧啶。

哺乳动物受精后，从父母遗传下来的DNA分子全部甲基化被特异性的酶清除。胚胎植入子宫后，新一轮的甲基化开始，受精卵的基因组在DNA甲基化酶的作用下再次发生甲基化。DNA甲基化的稳定性由DNMT1维持。

在哺乳动物中，DNMT1 和 DNMT3 是最重要的 DNA 甲基转移酶。DNMT1 参与 DNA 甲基化的维持，与 DNA 甲基化的延伸有关。DNMT3 包括 DNMT3a 和 DNMT3b，参与从头甲基化。DNMT 家族的其他作用和应用仍在研究中。

DNA去甲基化受基因内部片段及其结合因子调控，目前有两种假说可以解释DNA去甲基化的分子机制。一种假说与DNA半停留复制有关，即被动去甲基化。如果半停留复制后没有发生DNA甲基化，则DNA处于半甲基化状态。如果半甲基化的DNA再次发生半停留复制，DNA甲基化活性仍然受到抑制，则表明50%的细胞处于半甲基化状态。第二种假说与半停留复制无关，是一个主动过程，即DNA去甲基化是由DNA去甲基化酶催化的。DNA去甲基化是在DNA糖苷酶作用下甲基化碱基的去除，相当于糖苷酶和碱基游离核酸酶对受损DNA的修复。

DNA甲基化影响肿瘤基因表达

许多基因，特别是管家基因的启动子区，通常存在一些富含双核糖苷“CG”的区域，称为“CpG岛”，通常位于基因的启动子区和外显子区，部分区域富含CpG二核苷酸，长度为300–3,000个碱基对。启动子区特定CpG二核苷酸的甲基化参与转录调控。科学研究表明，DNA甲基化修饰在体外表现出较强的惰性。

大量研究表明，肿瘤细胞中抑癌基因和修复基因启动子区甲基化状态增强，导致相应抑癌基因表达受到抑制，且异常甲基化常见于慢性炎症状态，而这在很大程度上直接导致肿瘤和癌症的发生。

2015年一项关于CRC亚型联盟的研究总结了CRC的4种常见分子亚型（CMS）：CMS1、CMS2、CMS3和CMS4。其中CMS1突变率较高，微卫星不稳定的CRC均为CMS1，该类肿瘤甲基化状态和BRAF突变率较高，与其他类型相比预后较差。但在CRC分型中，其他CMS的染色体不稳定性（CIN）更多。虽然CMS3呈中度高甲基化，但KRAS基因突变率较高，CMS3型CRC一旦复发，死亡率较高。本研究以经典的染色体不稳定性（CIN）和微卫星不稳定性（MSI）通路以及其他CRC发病通路为例，阐明CRC的发生发展过程。

CIN 通路

研究表明，抑癌基因APC（Wnt信号通路调控因子）和TP53的突变，以及KRAS和PIK3CA的激活突变是CIN通路诱发肿瘤的相关事件。有趣的是，结直肠肿瘤中最早出现的事件似乎是APC的突变失活，从而导致Wnt信号通路被激活，这是几乎所有肿瘤的共同特征。

APC突变后，KRAS也会发生突变：KRAS基因开关在正常情况下，可以控制调控细胞增殖的通路；在异常情况下，则导致细胞持续增殖，并阻止自我毁灭。KRAS基因开关参与细胞内的信号转导，当KRAS基因发生突变时，其被永久激活，不能产生正常的RAS蛋白，导致细胞内信号转导错误，细胞增殖猖獗，以至癌变。

散发性CRC大多遵循CIN通路，而85%的散发性CRC有环氧合酶2（COX-2）表达，提示COX-2也是诱发肿瘤的重要因素。在结直肠肿瘤发生发展过程中，COX-2可能将游离的花生四烯酸转化为前列腺素，调控CRC细胞的增殖，可作为CRC治疗的一种替代方法。

MSI 通路

区域性高甲基化是具有MSI表型的CRC的共同特征，包括CpG岛甲基化表型（CIMP）。在Samowitz等的研究中，MSI和CIMP高癌症中均观察到APC突变，且APC突变与CIMP之间呈显著的负相关趋势。但是，上述APC和TP53的突变频率在MSI通路中低于在CIN通路中。

MSI通路的致癌作用包括TGF-βR2基因突变。TGF-βR2基因编码一种抑制结肠上皮细胞增殖的蛋白质，该基因突变的表达产物不再发出阻止增殖的信号，导致结肠上皮细胞异常增殖。其他突变基因导致细胞周期停滞（CASP5和FAS）和DNA修复异常（MBD4、BLM和CHK1）。

其他途径

锯齿状通路是另一种多步骤致癌机制。研究表明，锯齿状结肠直肠病变很少发生截短型 APC 突变，大多数为 BRAF 突变，而 KRAS 突变仍然罕见。关于锯齿状通路，56% 的 CRCS 中有梭杆菌存在，这与 CIMP-H 状态和大肿瘤有关。

此外，IBD-CRC 可能代表一种独特的致瘤途径。与 Wnt 信号传导相关的典型上皮性肿瘤亚型在 IBD-CRC 中完全缺失，而 Wnt 通路失调的不同机制使 IBD-CRC 偏向于间质性肿瘤亚型（表I）。

CRC 中几个关键基因的 DNA 甲基化变化

DNA甲基化是指在DNMT作用下，SAM将甲基添加到DNA分子的碱基上。胞嘧啶5碳原子与CpG中碱基之间的共价键是最常见的修饰方式。DNA甲基化修饰在体外比在生物体内表现出更强的惰性，例如亚硫酸氢钠可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但不能改变甲基化的CpG中的胞嘧啶，而在体内则导致基因表达降低。因此，高甲基化状态表示基因表达的失活/抑制/沉默，而低甲基化状态则表示基因表达的激活。早期研究表明，肿瘤细胞在基因组水平上存在广泛的低甲基化，导致原癌基因的激活和基因组不稳定性增加。近来发现，肿瘤细胞中抑癌和修复基因启动子区发生高甲基化，从而引起相应抑癌基因表达的抑制；另外，研究还发现肿瘤细胞的高甲基化主要发生在启动子区的CpG岛，尽管相应细胞大多处于非甲基化状态。

高甲基化

抑癌基因CpG岛高甲基化是CRC形成的机制之一，目前已发现多种癌基因发生高甲基化，只有主动转录、主动去甲基化、复制定时、阻止脱氧核糖核酸甲基转移酶获得局部染色质结构等少数保护机制能够阻止CpG岛高甲基化。

近期，ADHFE1、CNN1 和 NR3C1 的高甲基化已被揭示在信号转导、细胞周期调控、血管生成以及 CRC 中起重要作用。Suzuki等报道，CRC 患者正常结肠黏膜中 SFRP 基因（Wnt 信号通路负调节剂）的高甲基化和下调发生率高于非 CRC 患者黏膜。

荟萃分析显示，ITGA4 启动子甲基化状态与恶性肿瘤之间存在关联，即 IITGA4 高甲基化在肿瘤样本中比在非肿瘤样本中更常见。ITGA4 甲基化分析为筛查组织样本中的 CRC 提供了一种可靠的方法。这对于早期 CRC 的检测具有重要意义。

启动子高甲基化可能是导致结直肠癌中ADAMTS14表观遗传沉默的原因。ADAMTS14蛋白在侵袭性肿瘤前部的表达高于肿瘤中心或肿瘤其他区域。其高表达与结直肠癌患者预后不良相关，提示ADAMTS14可能是评估结直肠癌预后的有希望的指标。

低甲基化

低甲基化，包括 CIN 和 MSI，被认为通过激活原癌基因（如 CMYC 和 HRAS）或导致基因组不稳定来促进肿瘤发生。

亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR) 有两种常见的低功能多态性变体：核苷酸 677 处的 T 变体 (MTHFR C677T) 和核苷酸 1298 处的 C 变体 (MTHFR A1298C)。第一种变体 C677T 与 CRC 风险降低有关，与 MTHFR 多态性相关的癌症风险可能受叶酸摄入量的调节。如果叶酸摄入充足，携带变体 MTHFR 基因型的个体患癌症的风险可能会降低。当叶酸摄入量低时，多态性个体的 DNA 甲基化和 DNA 合成/修复可能会受损，从而增加患癌症的风险。动物研究表明，叶酸缺乏会导致 p53 基因外显子特异性低甲基化和 DNA 甲基转移酶活性增加。然而，中度叶酸缺乏不会导致 DNA 甲基化。研究发现，MTHFR C677T多态性通过与叶酸状态相互作用影响DNA甲基化状态。另一项研究通过评估其基因多态性（C677T）修饰的影响，探讨了血浆叶酸状态与结直肠腺瘤的关系。与CC叶酸代谢正常或CT叶酸代谢减低的受试者相比，TT叶酸代谢不良的受试者在血浆叶酸水平较高时，罹患结直肠腺瘤的风险较低（校正比值比，0.58，95%可信区间，0.21～1.61），而在叶酸水平较低时，罹患结直肠腺瘤的风险增加（校正比值比，2.13，95%可信区间，0.82～5.54）。这表明，当叶酸摄入量低或代谢异常，即DNA甲基化程度较低时，罹患CRC的风险降低。这也为通过控制叶酸摄入量或使用DNA甲基化抑制剂治疗CRC的临床治疗提供了突破。

本研究发现，在CRC病例中，HER3基因表达上调和低甲基化。HER3的高表达和低甲基化可能在CRC的发生和发展中起重要作用。CpG低甲基化可能与肿瘤发生的早期阶段有关。该生物标志物的发现为改进目前的诊断和治疗方法提供了有力的方法。

关键基因

KRAS是鼠肉瘤病毒致癌基因。RAS基因家族中有三个基因与人类肿瘤相关：HRAS、KRAS和NRAS，分别位于11、12和1号染色体上。KRAS编码一个21kDa的RAS蛋白，又称p21基因，对人类癌症的影响最大。它就像一个分子开关：正常时，能控制调控细胞增殖的通路；异常时，则导致细胞不断增殖，防止细胞自我毁灭。它参与细胞内信号传递。当KRAS发生突变时，该基因被永久激活，不能产生正常的RAS蛋白，导致细胞内信号转导障碍，即不能控制细胞增殖，从而导致癌症。

CRC 的特征是一系列涉及 APC、KRAS 和 TP53 的突变事件。KRAS 是 CRC 中最显著的致癌突变，发生在 30%-40% 的 CRC 患者中。KRAS 与 Wnt/β-catenin 通路协同作用，促进 CRC 并产生对抗 EGFR 抗体的耐药性。

SLC25A22 过程是表达活化 KRAS 的 CRC 细胞存活所必需的，然后 KRAS 迅速被纳入三羧酸循环（谷氨酰胺水解）。在没有谷氨酰胺的情况下，细胞仅通过与琥珀酸孵育即可增殖。KRAS 突变的细胞中 α-酮戊二酸与琥珀酸的比率较低，导致 5-羟甲基胞嘧啶（DNA 去甲基化的标志）和 CpG 位点的高甲基化降低。许多高甲基化基因位于 Wnt 信号通路和 5q31 染色体的促钙粘蛋白基因簇中。在没有 KRAS 突变或有 KRAS 突变和 SLC25A22 敲除的 CRC 细胞中，表达的促钙粘蛋白基因在这些位点未甲基化。

综上所述，在表达活化型KRAS的CRC细胞中，SLC25A22促进琥珀酸的积累，导致DNA甲基化增加，激活Wnt信号，从而增加β-catenin和LGR5的表达，并产生增殖、干细胞特性和对5-氟尿嘧啶的耐药性。阻断该通路的策略可能在未来用于治疗CRC（图2）。

图2.  DNA甲基化是指在DNMT作用下，S-腺苷甲硫氨酸在DNA分子的碱基上添加甲基。如亚硫酸氢钠可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但不能改变甲基化的CpG中的胞嘧啶（30）。KRAS是CRC中最重要的致癌突变，在表达活性KRAS的CRC细胞中，这些KRAS需要SLC25A22参与，并迅速掺入TAC中，同时SLC25A22促进琥珀酸的积累，导致DNA甲基化增多。在无KRAS突变或KRAS突变且SLC25A22敲除的CRC细胞中，表达的黏附素前基因在这些位点没有被甲基化。DNMT，DNA甲基转移酶；CRC，结直肠癌；SLC25A22，溶质载体家族25成员22；TAC，三羧酸循环；Glu，谷氨酰胺。

DNA甲基化在CRC中的临床意义

使用甲基化标记诊断 CRC

DNA甲基化是一种化学修饰，可以在不改变DNA序列的情况下改变遗传特性。DNA甲基化的发生率随着年龄的增长而增加，这表明甲基化可能与衰老和致癌有关。在CRC（结直肠息肉）前体的研究中，患者的DNA序列中也发现了类似的异常甲基化积累，这表明CRC中的甲基化生物标志物检测可能是未来的一大趋势。此外，人们认为，通过不同类型肿瘤的特异性甲基化也可以追踪肿瘤的起源，这有助于确定患者的药物和其他治疗策略。有趣的是，类似的甲基化也发生在健康人的结肠粘膜中，这意味着使用甲基化生物标志物可以预测结肠癌的可能性。如前所述，作者认为其中一些基因，如BRAF和KRAS，可能为甲基化生物测定研究提供关键突破。

此外，MSI 和 CIN 是 CRC 的两种重要类型。MSI 癌症是由 DNA 错配修复 (MMR) 基因突变和启动子区域高甲基化引起的。MMR 是在 DNA 复制过程中通过纠正错误的碱基对而产生的蛋白质。因此，检测 MMR 状态可以在一定程度上预测 CRC 的发病率。

Hinoue等的研究将CRC病例分为CIMP-high、CIMP-low、非CIMP类型，其中CIMP-high亚组癌相关基因呈高甲基化，BRAFV600基因发生突变，MLHL呈高甲基化；CIMP-low亚组KRAS突变丰富，以CIMP-h相关标志物亚组DNA高甲基化为特征。

首先，Jensen等的研究强调了利用血液样本中 DNA 甲基化标志物的敏感性和特异性来检测早期肿瘤的潜在用途。三甲氧基是一种检测早期 CRC 的微创方法，源自对血液中三种肿瘤特异性 DNA 甲基化标志物的评估。一项研究显示，CRC 细胞对三甲氧基的敏感性达到 78%，特异性接近 100%。该方法无疑为 CRC 的早期预测开辟了道路。最近，根据 Li 等的研究，SEPT9、SDC2 和 ALX4 甲基化状态可以覆盖肿瘤形成的多个分子途径，联合检测有望进一步提高 CRC 检测的敏感性。

此外，目前已开发出一种基于血浆 DNA 甲基化的新型生物标志物组合，并使用来自多个医疗中心的临床样本进行了验证。它有望为早期检测目标胃肠道癌症提供一种替代且经济有效的策略。

DNA 甲基化对预后的影响

由于多种类型的CRC均检测到高MSI状态，一些学者提出将MSI状态作为预后分析的主要标志物。但一项荟萃分析发现，对于未接受免疫治疗的I期和IV期CRC，MSI-H并不是一个强有力的预后标志物。有趣的是，Popat等人提出MSI状态作为患者管理的一种前瞻性条件。因此，他们的研究表明使用氟尿嘧啶的MSI患者具有更好的生存率；然而，解释MSI患者预后改善的原因以及氟尿嘧啶的作用机制对后来的研究者来说是一个巨大的挑战。先前的研究还假设肿瘤抑制基因TP53和KRAS中的基因突变在MSI肿瘤中很少见，并且这些基因突变可能与不良预后相关。

SMAD4是一种抑癌基因，是转化生长因子（TGF）-β信号通路的组成部分，与细胞增殖、分化、迁移和凋亡有关。据报道，甲基化可导致DPC4/SMAD4基因激活，该基因在CRC的发展中起重要作用。研究还指出，DPC4/SMAD4是预后分析的重要因素。

SDS2 甲基化可作为评估 CRC 患者术前和术后粪便 DNA 的潜在生物标志物，并可用于确定 CRC 手术切除后粪便 DNA 中甲基化的 SDC2 是否恢复正常。

DNA甲基化与靶向治疗的关系

CRC以基因启动子高甲基化和整体低甲基化为特征，但DNA甲基化是一把双刃剑，既影响肿瘤的发生发展，也是治疗的有利位点，本研究总结了几个研究较为深入的甲基化靶向治疗位点。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p16INK4a

在约 30% 的 CRC 患者中可检测到 p16INK4a 甲基化，而 p16INK4a 突变可导致 BRAF 突变，而该突变已被证明是小鼠肠道肿瘤发生的直接原因。因此，p16INK4a 可以抑制肿瘤形成，而靶向去甲基化可能成为一种新的治疗方法。

RASSF1

80% 的 CRC 中可检测到 RASSF1 启动子高甲基化。有趣的是，有研究表明，敲除小鼠的 RASSF1 基因会增加 CRC 的风险，这表明 RASSF1 可能是一种肿瘤抑制基因。

细胞分裂周期 7（Cdc7）

研究已发现 CRC 中存在 Cdc7 体细胞突变，临床研究正在进行中。这些发现强调了 Cdc7 在靶向治疗中的潜力。

DNA 甲基化是 CRC 的重要治疗靶点

临床前研究：

DNA甲基化抑制剂对结直肠肿瘤细胞的影响

在结肠癌形成过程中，DNA上多个基因位点发生高甲基化，导致抑癌基因等重要基因失活，因此DNA甲基转移酶抑制剂可以抑制特定位点的甲基化，纠正错误的甲基化修饰，直接改变基因表达。

DNA甲基化是调控基因表达的生理过程，DNA甲基化的形成和维持是在DNMT的作用下实现的，DNMT有三个家族，分别是DNMT1（在DNA半保留复制过程中活性加快）、DNMT2和DNMT3（包括DNMT3a、DNMT3b和DNMT3l），人体拥有DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。

DNMT3a和DNMT3b在胚胎发育过程中起着催化 从头甲基化的重要作用，也有研究认为DNMT3a和DNMT3b可能纠正DNMT1留下的错误，参与维持DNA甲基化模式。三种DNMT均维持DNA甲基化，在正常组织中呈低表达，在肿瘤组织中呈高表达。以DNMT为靶点逐渐成为药物研发的新方向。

草药

近年来，中医治疗越来越受欢迎。自古以来，就有中药用于治疗结直肠癌，如乌梅丸和四逆汤。其中，许多天然化合物已被发现通过作用于其甲基化基因来治疗结直肠癌。人参就是其中一个例子。它通过调节结直肠癌细胞中的凋亡相关基因来增强细胞凋亡，并下调 DNMT 的表达并降低结直肠癌细胞的整体甲基化水平。有研究表明维生素作为 DNA 甲基化修饰剂具有良好的作用，但还需要改进研究设计的研究。

一项临床研究表明，每天口服 0.5-1 克白藜芦醇可在人体胃肠道中产生抗癌作用，同时癌症患者的耐受性良好。它实际上通过 DNA 甲基化调节肿瘤细胞的表观遗传变化来抑制癌症扩散。

姜黄中的姜黄素可诱导结直肠癌细胞中特定 CpG 位点的去甲基化，但不会诱导整体 DNA 甲基化变化。姜黄素诱导的甲基化变化以基因和细胞系特异性的方式发生，并对参与重要生物过程的各种基因的转录产生直接影响。大量实验表明，一些天然化合物可通过 DNA 甲基化治疗结直肠癌，证明 DNA 甲基化可作为治疗结直肠癌的靶点。

单独使用抑制剂

DNA甲基转移酶抑制剂有核苷类和非核苷类两类，前者包括5-氮杂胞嘧啶及其衍生物，后者包括多酚表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和rgl08。

尽管多种化合物可以抑制哺乳动物细胞的 DNA 甲基化，例如染料木黄酮 (GE) 和姜黄素，但唯一得到广泛测试的 DNA 甲基化酶抑制剂是 ZCyd（5-氮杂胞苷）、DZCyd（5,6-二氢-5-氮杂胞苷，也称为 DHAC）和 ZdCyd（地西他滨）。这三种化合物只有当其掺入 DNA 中时才能抑制 DNA 甲基化。如前所述，ZdCyt 是一种比 ZCyd 更有效的 DNA 甲基化抑制剂，因为它只与 DNA 结合。此外，ZCyd 是作为 ZCyd 的更稳定的类似物合成的，其在体内阻断甲基化方面至少比 ZdCyt 弱一个数量级。这是因为 ZdCyt 在 DNA 中的掺入有限，因为它不能被胞苷激酶有效地磷酸化。然而，数据显示，CRC 可以用 ZCyd 治疗。

ZNF671 被发现是多种肿瘤中重要的癌症抑制剂。在 CRC 中发现 ZNF671 基因启动子区高甲基化水平，与 ZN671 表达呈负相关。它通过抑制 Notch 信号在 CRC 中发挥肿瘤抑制作用。这表明 ZNF671 可作为 CRC 治疗的候选靶点。

临床研究

DNA甲基化的变化甚至可能是转移性癌症转化的重要介质：一些重要的纵向研究描述了甲基化的显著且可重复的变化。此类研究已针对结直肠癌、前列腺癌和乳腺癌完成。E-钙粘蛋白（CDH1）被广泛认为是乳腺癌转移的DNA甲基化的靶点。值得注意的是，在各种肿瘤类型的循环肿瘤细胞中都观察到了转移抑制基因的DNA甲基化。这增加了DNA甲基化也可能是转移的有用预后标志物的可能性。值得注意的是，泛癌症荟萃分析确定了与乳腺癌和结直肠癌转移相关的甲基化位点。因此，甲基化DNA作为预后、诊断和转移标志物的潜力是一个有待进一步探索的领域。

组织学上，正常结肠黏膜组织与癌前病变结肠组织在分子水平上可以区分开，因此DNA甲基化的改变可以作为结肠癌的标志。但DNA甲基化的可逆性也从表观遗传学的角度为CRC的治疗提供了理论基础，研究发现特定基因的DNA甲基化结果分析有望为临床医生提供早期诊断、疾病分期等有用信息。这些DNA甲基化抑制剂虽然具有强效去甲基化作用，但可能伴有较强的细胞毒性，且作用位点选择缺乏特异性，因此还需要更多的研究来解决这些问题，以促进DNA甲基化抑制剂在临床的广泛应用（表2）。

结论与展望

DNA甲基化与CRC的研究前景广阔，作者认为基因组序列中的DNA甲基化可作为预测CRC发病率、分子分型及癌症患者预后的重要标志物，需要进一步的实验来提高DNA甲基化谱的利用率。DNA甲基化有望成为CRC筛查的重要位点，灵敏度高是其最大优势，有助于降低误诊率，因此需要通过进一步的深入研究明确不同类型CRC对应的甲基化标志物，利用甲基化生物标志物来识别癌细胞应是未来的趋势，减少侵入性检查对机体造成的损伤也是一大研究方向。

研究表明CRC是一种高度异质性的疾病，例如MLH1基因高甲基化仅见于少部分散发性CRC病例，这使得患者的治疗可以个体化，但每个患者在药物敏感性、治疗效果、死亡率等方面都有较大差异，但由于表观遗传学具有可逆性，即DNA甲基化是可逆的，这为CRC的治疗提供了新的策略。DNMT抑制剂有望成为治疗CRC的靶向药物，可用于针对高甲基化的CRC亚型患者。例如，氮胞苷、地西他滨、替莫唑胺等特异性药物可以逆转DNA的甲基化状态，达到靶向治疗CRC的目的，但这些药物对不同CRC亚型的敏感性和有效性还需要更多的临床研究来证明。另外，这些药物的副作用对预后也有明显影响。临床上，可根据患者的不同症状制定更合适的治疗方案，对症用药，提高治疗效果。因地制宜用药，减少副作用，改善肿瘤预后才是最佳策略。由于肿瘤细胞间存在异质性，转移潜能信号的识别十分复杂，距离这一目标还有很长的路要走。

免疫治疗是结直肠癌治疗的一个新兴领域，DNA甲基化可能与免疫治疗的效果相关。有报道称，肿瘤微环境中m6甲基化介导的细胞间通讯起着抗肿瘤免疫调节作用；而RNA N6-甲基腺苷擦除剂ALKBH5可作为促进结直肠癌免疫治疗的靶点。最近的研究表明，结直肠癌细胞中上调的THBS2表达通过HIF1A /乳酸/GPR132通路抑制抗肿瘤免疫。此外，THBS2的表达还与PFI、免疫细胞浸润和免疫调控有关。此外，一些小鼠实验显示表观遗传学与免疫治疗相结合比单独使用阻断剂更有效，这进一步证明了甲基化免疫治疗的可行性。科学家也继续积极探索甲基化与免疫逃逸、免疫治疗耐药性之间的关系，寻找新的免疫治疗策略，提高患者的治愈率。

DNA甲基化在CRC研究领域有着广阔的应用前景，通过深入研究甲基化在CRC的发生机制和调控网络，有望为CRC的早期诊断、个体化治疗及免疫治疗提供新的突破点，从而改善患者的预后和生存率。

本研究认为DNA甲基化可以作为CRC早期诊断的生物标志物，通过检测粪便中DNA的甲基化状态，可以检测出微小残留病灶，有助于早期发现疾病。此外，DNA甲基化在CRC的预后中也起着重要作用，通过检测甲基化状态可以判断患者的生存率和生活质量。随着测序技术和生物信息学的发展，CRC中DNA甲基化的研究将会更加深入。总之，DNA甲基化在CRC研究中仍然具有巨大的潜力，为CRC的治疗提供了更多的可能性。